含铜不锈钢对血管内皮细胞黏附、增殖及凋亡的影响

徐璐　张扬　杨柯等

[摘要] 目的 观察含铜不锈钢对血管内皮细胞黏附、增殖及凋亡的影响，并与316L不锈钢进行比较。方法 将血管内皮细胞接种于两种材料表面，在培养1、2、3 d后，应用吖啶橙染色及甲基噻唑基四唑（MTT）法检测细胞在两种材料表面黏附和增殖活性。并制备两种材料的浸提液，用浸提液培养血管内皮细胞，采用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 荧光显微镜下，细胞在两种材料表面均伸展良好，呈铺路石状生长。在培养1、2 d时，含铜不锈钢组黏附的细胞数多于316L不锈钢组（P<0.05）；3 d时两组间差异无统计学意义（P>0.05）。MTT结果显示，含铜不锈钢组在1、2 d的吸光度值高于316L不锈钢组，差异有统计学意义（P<0.05）；而在培养3 d后，两组间差异无统计学意

义（P>0.05）。316L不锈钢组的早期凋亡率高于含铜不锈钢组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 含铜不锈钢较

316L不锈钢更利于血管内皮细胞的黏附及增殖，并可以降低血管内皮细胞的早期凋亡率。

[关键词] 含铜不锈钢； 血管内皮细胞； 黏附； 增殖； 细胞凋亡

[中图分类号] R 783.5 [文献标识码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.005 在正畸治疗中，支抗控制贯穿于整个治疗过程，是治疗成败的重要因素之一[1]。微种植体的支抗作用

是通过种植钉与骨界面的组织学机械锁结和骨结合，从而抵抗一定限度内的矫治力[2]。在种植体愈合过程

中，新生血管的形成早于成骨活动的开始[3]。血管内皮细胞合成和分泌的调节因子具有调控成骨细胞趋化、增殖及分化的功能[4]。而细胞的生物学行为受生物材料自身性能的影响[5]。因此，不同种植材料很可能会影响种植体-骨界面血管内皮细胞的生物学性状。中国科学院金属研究所研发的含铜不锈钢具有良好的抗菌性能和生物相容性，能有效预防种植体周围细菌感染的发生[6-7]。本实验旨在观察含铜不锈钢对血管内皮细胞黏附、增殖及凋亡情况的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人脐静脉内皮细胞株EA.hy926由中国医科大学中心实验室提供。

1.1.2 实验材料 316L不锈钢为医用级不锈钢，成分：Cr18%，Ni12%，其余为Fe。含铜不锈钢（316L-

Cu），成分：Cr18%，Ni12%，Cu4%，其余为Fe，材料由中国科学院金属研究所提供。

1.1.3 主要试剂和设备 DMEM、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亚砜（di-methylsulfoxide，DMSO）、胰蛋白酶（Sigma公司，美国），胎牛血清（杭州四季青生物有限公司），吖啶橙

（上海化学试剂公司），Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司），荧光倒置显微镜（Nikon公司，日本），流式细胞仪（BD公司，美国），

自动酶标检测仪（Tecan公司，奥地利）。

1.2 方法

1.2.1 试件的制备 将含铜不锈钢和316L不锈钢制备成两种规格试件。一种为直径10 mm、厚2 mm，各15片，用于黏附实验和增殖活性检测；另一种为直径25 mm、厚2 mm，各5片，用于制备浸提液。上述材料经超声清洗、干燥，高温高压（33 MPa、121 ℃）灭

菌处理后备用。

1.2.2 浸提液的制备 将直径25 mm、厚2 mm的两种不锈钢材料置于6孔培养板中，按试件表面积与培养液之比为3 cm2·mL-1加入DMEM培养液，置于37 ℃培养箱内，浸泡72 h后收集浸提液。

1.2.3 黏附和增殖活性检测 将直径10 mm、厚2 mm的两种不锈钢试件置于无菌24孔板中。用0.25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的血管内皮细胞，制备成密度为每毫升2×104个的细胞悬液，接种到各材料表面，静置3 h后，从各孔板侧壁缓慢加入DMEM培养基1 mL。标准条件下分别培养1、2、3 d后，将两种材料各取出2片，PBS冲洗3次，95%乙醇固定10 min，晾干，加入0.1 mg·mL-1吖啶橙染液，0.1 mol·L-1氯化钙分色。在荧光显微镜下观察细胞在不同材料表面的黏附情况，随机选取上、下、左、右、中5个视野拍照并计数。用MTT法检测两种材料表面血管内皮细胞的增殖活性。在培养1、2、3 d后，分别取出两种不锈钢材料各3片，PBS冲洗后，置于一预先加入DMEM培养液的新24孔板内。每孔加入5 mg·mL-1的MTT试剂80 μL，继续培养4 h后，弃培养基，每孔加入450 μL DMSO，37 ℃下静置2 h，待蓝紫色结晶物彻底溶解后，振荡10 min。将每孔中的液体按每孔150 μL吸入96孔板中，用酶标仪读取吸光度值（A值）（波长490 nm），实验重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 将浓度为每毫升2×105个的血管内皮细胞接种于3块6孔板中，分别设计为含铜不锈钢组、316L不锈钢组和对照组。培养24 h后，用浸提液置换孔板中的培养液，对照组用新培养液置换，继续培养24 h。用0.25%胰酶消化细胞，1 000 r·min-1下离心后重悬，制成单细胞悬液，分别加入Annexin V-FITC和PI，避光反应15 min，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行分析，数据以x±s表示，对黏附在材料表面的细胞数及增殖活性采用t检验进行分析，对细胞凋亡率采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光显微镜观察结果

荧光显微镜下，细胞呈多角形，铺路石样排列（图1）。在培养1、2 d后，含铜不锈钢组材料表面黏附的内皮细胞数明显多于316L不锈钢组（P<0.05）；而在3 d后两组材料表面黏附的内皮细胞数量差异不明显（P>0.05）（图2）。

2.2 MTT法检测细胞增殖活性

培养1、2 d时，含铜不锈钢组A值高于316L不锈钢组（P<0.05）；而培养3 d时，两组A值间差异不明显（P>0.05）（图3）。

2.3 流式细胞仪检测结果

各组细胞均以正常细胞为主，凋亡细胞在各组间分布不均。316L不锈钢组早期凋亡的血管内皮细胞多于含铜不锈钢组和对照组（图4）。

2.4 细胞凋亡率的测定

316L不锈钢组、含铜不锈钢组、对照组的细胞凋亡率分别为5.23%±0.35%、1.96%±0.18%、1.45%±0.15%。经统计学分析，两种不锈钢组与对照组相

比，细胞凋亡率间差异有统计学意义（P<0.05）；两

种不锈钢组相比，细胞凋亡率间差异有统计学意义（P<0.05）。

Fig 2 The numbers of endothelial cells on two kinds of materials

surface

Fig 3 Proliferation of endothelial cells on two kinds of materials

surface

3 讨论

微种植体支抗在正畸临床应用中较传统支抗方式相比，具有稳定、舒适、不依赖于患者配合等优点，提供了一种相对稳定的口内强支抗。目前使用的微种植体材料，一般为纯钛、钛合金及不锈钢种植体。钛的生物相容性较好，骨结合能力强，但其材质较脆，易折断。不锈钢与钛相比，具有良好的延展性和强度，穿透能力强，可抵抗一定程度的旋转力，降低种植体折断的风险。但在临床应用中，种植体周围炎的发生而导致种植体松动、脱落已成为微种植体失败的重要原因之一[8]。本实验中应用的

含铜不锈钢是一种集结构与功能于一体的新型生物医用材料。含铜不锈钢在体内会释放微量的铜离子，经证明能有效地杀灭引起种植体周围炎的常见致病菌[7]，因此是一种极具开发潜力的微种植体材料。

种植体植入后起初被凝血块包绕，随后成骨细胞分化并参与骨形成[9]。骨形成是骨内微环境中血管

内皮细胞、成骨细胞和破骨细胞之间共同作用的结果[10]。相关研究表明：血管内皮细胞合成的血管发

生因子能促发丝裂原反应，在骨结节的形成中发挥重要作用[11]。同时，血管内皮细胞释放的内皮素-1

可结合成骨细胞膜上存在的相应受体，从而刺激骨形成[12]。而血管内皮细胞分泌的一氧化氮可通过旁

分泌的形式作用于破骨细胞，抑制其骨吸收功能[13]。

以上结果提示：血管内皮细胞合成和分泌的调节因子对成骨细胞及破骨细胞均具有调控作用。此外，种植体的愈合过程必须依赖充分的血供，血管内皮细胞形成的新生血管为氧气、营养物质及代谢废物的运输提供通道。因此，血管内皮细胞为种植体界面的愈合提供了良好的生物学基础。

血管内皮细胞在种植材料表面的黏附情况，直接影响到其增殖、分化以及在种植体-骨界面愈合中的作用。本实验通过吖啶橙染色，在荧光显微镜下观察、比较血管内皮细胞在两种不锈钢材料表面的黏附情况。其原理为：吖啶橙能与活细胞中双螺旋DNA结合，形成发绿色荧光的复合物。在共培养1、2 d后，含铜不锈钢组表面黏附的内皮细胞多于316L不锈钢组。Barbucci等[14]等研究表明：含有Cu2+的透明质酸复合物对血管内皮细胞的迁移和黏附具有促进作用。此外，MTT检测结果也显示，含铜不锈钢组细胞的增殖活性高于316L不锈钢组。分析原因可能是含铜不锈钢富铜相中的铜以Cu2+形式溶出，对血管内皮细胞的增殖产生影响[15]。

增殖和凋亡两者的动态平衡维持着组织的正常形态和功能。不同的合金材料由于成分、金相等差异，在析出金属离子的种类上有所不同，对黏附其表面细胞的影响也各有差别[16]。Annexin V作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一，其原理为：细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylse-rine，PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V能与外侧的PS特异性结合，标记早期凋亡的细胞。本研究通过流式细胞仪检测血管内皮细胞早期凋亡率，结果发现，316L不锈钢组的细胞凋亡率高于含铜不锈钢组，两者差异有统计学意义（P<0.05）。分析原因为：两种不锈钢各自的组成成分不同，进而引起细胞凋亡率之间存在差异。从而进一步推测，含铜不锈钢析出的Cu2+可能参与调控血管内皮细胞凋亡过程中的某一环节[17]。

本实验仅从细胞水平研究含铜不锈钢对血管内皮细胞黏附、增殖及凋亡的影响，而析出的Cu2+与血管内皮细胞的具体作用机制则有待于从分子水平进一步探究。

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（本文编辑 杜冰）