漳州血柚皮水溶性多糖的水提工艺

陈文娟,曾稍俏,陈建福

（1.漳州城市职业学院生物与环境工程系,福建漳州363000；2.福州大学化学化工学院,福建福州350108）

红肉蜜柚是福建省农业科学院果树研究所由漳州平和琯溪蜜柚园中的芽变株系选育而成的[1],因其肉色血红,坊间有人形象地称之为“血柚”.随着血柚年产量的增加,血柚皮等废弃物量也逐年增多,血柚皮中除含有多种人体必需的营养素外,还含有多种非营养性生理活性物质,如黄酮、多糖等[2-3],可作为抗氧化、抗病毒、抗过敏、抗衰老等药物的主要成分[4-5].植物多糖以其来源广泛、种类繁多、毒副作用小而得到广泛的研究[6-10],然而目前国内外对血柚多糖提取的研究尚未有文献报道.本文以血柚皮为原料,采用热浸提法对血柚皮多糖进行提取,并对提取工艺参数进行优化,优选出热浸提取血柚皮多糖的最佳提取工艺,旨在为血柚皮水溶性多糖的应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SHZ-D循环水式真空泵,郑州长城科工贸有限公司；UV－2000型紫外可见分光光度计,尤尼柯（上海）仪器有限公司；旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂；电子天平,赛多利斯科学仪器有限公司.

石油醚、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、无水乙醇、乙醚、正丁醇、氯仿等均为分析纯.

血柚皮：漳州市售血柚.

1.2 试验方法

1.2.1 血柚皮多糖的提取工艺 血柚皮—晾干—粉碎—乙醇浸泡—滤渣—石油醚脱色脱脂—蒸馏水回流提取—振荡除蛋白—抽滤—定容—测定含量.

流程说明：将市场采购的血柚子剥皮,将血柚皮自然晾干,于50℃干燥箱中干燥至恒重,冷却,粉碎,过100目筛备用.准确称取一定量的备用血柚皮置于一定量的无水乙醇中浸泡,浸泡完后过滤,滤渣经石油醚脱色脱脂,真空干燥箱中干燥后置于烧瓶中,加入一定量的蒸馏水,在设定温度下加热回流一定时间,回流完后加入 Sevage试剂（V正丁醇∶V氯仿=1∶4）混合振荡 30 min,离心去蛋白及有机溶剂,后抽滤,滤液于旋转蒸发仪中浓缩并转移定容至100 mL备用.

1.2.2 多糖含量的测定 采用苯酚—硫酸法测定血柚皮多糖含量,配制0.5 g/L的葡萄糖标准溶液,分别取葡萄糖标准液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 置于试管中,然后加水补至 2.0 mL,以第 1 根试管作为空白.各试管中分别加入体积分数为6%的苯酚1.0 mL,再迅速加入体积分数为98%的浓硫酸5.0 mL,摇匀,放置5 min,置沸水浴中水浴15 min,取出冷却至室温,于490 nm处测定吸光度.以葡萄糖溶液质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标,绘制标准曲线并得到回归方程为：y=5.903 5x+0.1127,R2=0.999 8.表明葡萄糖质量浓度在0.012 5～0.112 5 mg/mL范围内与吸光度有良好的线性关系.测定多糖时,按上述标准配制方法,测定其吸光度,并代入回归方程,即可得出多糖的浓度,多糖的提取率按下式计算：

2 结果与分析

2.1 影响血柚皮水溶性多糖提取率的单因素试验结果

2.1.1 料液比对血柚皮水溶性多糖提取率的影响 固定回流温度85℃,回流时间3 h,考察料液比对血柚皮水溶性多糖提取率的影响,结果如图1所示.从图1中可以看出,随着料液比的增加,水溶性多糖提取率增大,当料液比超过1∶30后,随着料液比的增大,水溶性多糖提取率反而降低,这是因为料液比较小时,热水中多糖含量高,热水中的多糖与颗粒中的多糖达到溶解的动态平衡,无法再多溶出,随着料液比的增大,溶解平衡被破坏,且料液比的增大,增加了溶出传质推动力,使得水溶性多糖提取率增大[8].而当料液比超过1∶30后,水溶性多糖含量降低,是因为液体量过大,增大了其他杂质的溶出,反而抑制了水溶性多糖的溶出.

图1 料液比对水溶性多糖提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction efficiency of water soluble polysaccharides

2.1.2 回流温度对血柚皮水溶性多糖提取率的影响 固定料液比1∶30,回流时间3 h,考察回流温度对血柚皮水溶性多糖提取率的影响,结果如图2所示.从图2中可以看出,随着回流温度的增加,水溶性多糖提取率增大,当回流温度超过85℃时,随着回流温度的增大,水溶性多糖提取率反而降低.这是因为随着温度的升高,血柚皮颗粒中的纤维软化,且溶剂的渗透力和溶解力提高,使得多糖更容易溶出[9],但是当温度过高时,由于多糖的热不稳定性及降解,而使得多糖损失,因而最佳的温度为85℃.

图2 回流温度对水溶性多糖提取率的影响Fig.2 Effect of temperature on extraction efficiency of water soluble polysaccharides

2.1.3 回流时间对血柚皮水溶性多糖提取率的影响 固定料液比1∶30,回流温度85℃,考察回流时间对血柚皮水溶性多糖提取率的影响,结果如图3所示.从图3中可以看出,随着回流时间的增加,水溶性多糖提取率增大,当回流时间超过3 h时,随着回流时间的延长,水溶性多糖提取率反而降低.这是因为随着回流时间的延长,多糖在水中的浸提更加充分,当回流时间为3 h时,水溶性多糖提取率达到最大.此后,水溶性多糖提取率又开始下降,这是由于过长时间的回流与加热,导致部分多糖结构被破坏[10],造成水溶性多糖的提取率下降,因此最佳的回流时间为3 h.

图3 回流时间对水溶性多糖提取率的影响Fig.3 Effect of time on extraction efficiency of water soluble polysaccharides

2.2 正交试验优选血柚皮水溶性多糖提取工艺

在单因素试验的基础上,选用L9（34）正交表进行正交试验,以料液比、回流温度、回流时间为试验因素,每个因素取3水平进行优选,以水溶性多糖提取率为考察指标,并进行极差分析、方差分析确定水提法提取血柚皮中水溶性多糖的最佳工艺参数,其结果见表1至表3.

表1 正交试验因素水平表L9（34）Tab.1 Factor levels of orthogonal experiments L9（34）

表2 水溶性多糖提取工艺正交试验结果Tab.2 Orthogonal array design matrix and results

由表2的极差可知,影响水提法提取血柚皮中水溶性多糖的工艺中各影响因素的主次为：A＞B＞C,即料液比＞回流温度＞回流时间,最佳工艺为A3B2C3.将正交结果进一步进行方差分析可知料液比有极显著差异（F0＞F0.01）,而回流温度和回流时间差异显著（F0.05≤F0＜F0.01）（见表 3）.

表3 正交试验结果方差分析Tab.3 Variance analysis for orthogonal array design experimental results

2.3 正交试验各处理间的多重比较

2.3.1 料液比各水平间差异显著性的SSR检验 从表4的SSR检验可以看出,料液比水平3与水平2、水平1之间存在极显著性差异（P＜0.01）.水平2与水平1之间存在显著性差异（P＜0.05）.所以最佳的料液比为 1∶35,而 1∶30 和 1∶25 不合适.

表4 料液比各水平间差异显著性的SSR检验Tab.4 Notability difference in solid-liquid ratio with the statistic method of SSR

2.3.2 回流温度各水平间差异显著性的SSR检验 从表5的SSR检验可以看出,回流温度水平2与水平3、水平1存在显著性差异（P＜0.05）.水平3与水平1不存在显著性差异（P＞0.05）.所以最佳的回流温度为85℃,其次是80℃和90℃.

表5 回流温度各水平间差异显著性的SSR检验Tab.5 Notability difference temperature of with the statistic method of SSR

2.3.3 回流时间各水平间差异显著性的SSR检验 从表6的SSR检验可以看出,回流时间水平3与水平1不存在显著性差异（P＞0.05）,而与水平2存在显著性差异（P＜0.05）.水平1与水平2存在显著性差异（P＜0.05）.所以最佳的回流时间为3.5 h和2.5 h,其次是3 h.由于回流时间2.5 h与3.5 h不存在差异,从能源节约方面考虑,可将回流时间参数修正为2.5 h.

表6 回流时间各水平间差异显著性的SSR检验Tab.6 Notability difference of time with the statistic method of SSR

2.4 验证结果

取一定量的血柚皮样品,根据正交极差法得到的最佳工艺条件和修正后的最佳工艺做3组平行实验,水溶性多糖的提取率测定结果见表7.从表7和表2中可以看出,修正后的最佳水提条件与表2中的序号8的实验工艺条件相同,且所测得的水溶性多糖提取率均大于（序号8除外）正交设计表中其他提取条件下水溶性多糖的提取率,且提取条件修正对提取结果不会产生影响.

表7 实验结果验证Tab.7 Experiment results of best condition

3 结论

采用热浸提法处理血柚皮,并提取血柚皮中的水溶性多糖,考察了料液比、回流温度、回流时间对水溶性多糖提取率的影响,通过正交试验,优选出提取血柚皮水溶性多糖的最佳工艺条件为A3B2C3,即料液比为1∶35,回流温度为 85℃,回流时间为 3.5 h.方差分析显示,料液比有极显著差异（F0＞F0.01）,而回流温度和回流时间有显著差异（F0.05≤F0＜F0.01）.通过各因素间的多重比较,表明最佳工艺参数为料液比1∶35,回流温度85℃,回流时间2.5 h.通过验证,最佳提取工艺A3B2C3和修正后的工艺A3B2C1的水溶性多糖提取率实验结果一致,且水溶性多糖提取率均大于（序号8除外）正交设计表中其他提取条件下水溶性多糖的提取率,该工艺可用于血柚皮中水溶性多糖的提取.

[1]胡宁三,蔡盛华,陆修闽,等.柚类新品种—红肉蜜柚[J].云南农业科技,2008,42（5）：47-48.

[2]Sui Z Q,Gizaw Y,BeMiller J N.Extraction of polysaccharides from a species of Chlorella[J].Carbohydrate Polymers,2012,90（1）：1-7.

[3]陈文娟,陈建福.漳州血柚皮总黄酮的提取工艺研究[J].北京联合大学学报：自然科学版,2012,26（4）：40-45.

[4]Na Y S,Kim W J,Kim S M,et al.Purification,characterization and immunostimulating activity of water-soluble polysaccharide isolated from Capsosiphon fulvescens[J].International Immunopharmacology,2010,10（3）：364-370.

[5]Cheng H R,Li S S,Fan Y Y,et al.Comparative studies of the antiproliferative effects of ginseng polysaccharides on HT-29 human colon cancer cells[J].Medical Oncology,2011,28：175-181.

[6]计红芳,张令文,张磊,等.柠檬蜡伞多糖的提取工艺研究[J].河南科技学院学报：自然科学版,2011,39（4）：20-23.

[7]刘国聪,曾楚杰,刘力恒,等.沙田柚皮水溶性多糖的提取工艺研究[J].广州化学,2007,32（3）：40-45.

[8]郭守军,杨永利,李浩龙,等.银合欢种子多糖提取工艺优化[J].中国酿造,2012,31（11）：98-101.

[9]林国卫,周丽明,张勇,等.水溶性葛根多糖提取条件研究[J].江苏农业科学,2012,40（11）：285-286.

[10]王丽艳,荆瑞勇,阮洪生,等.芦柑皮中水溶性多糖提取条件的研究[J].食品科学,2009,30（6）：117-119.