凤仙花花芽总RNA不同提取方法的比较

董娜,刘荷芬,周修任

（河南科技学院,河南新乡453003）

RNA提取是分子生物学研究的基础.在进行Northern杂交分析、基因体外翻译、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增（RACE）和差异显示反转录PCR（DDRT-PCR）等研究中均需要高质量的RNA.然而,由于RNA不稳定、易降解,一旦提取的RNA质量不好,在反转录时往往无法合成cDNA或合成的cDNA链长短不一,给研究带来不便.

通常提取RNA的方法有多种,包括CTAB法、异硫氰酸胍法、SDS/酚抽提法、苯酚法和氯化锂沉淀法及各种商品化的试剂盒等.由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性,使得植物组织RNA的提取相对于其他生物材料来说要困难得多.实践中经常会发现,即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法也会有很大的不同,对于某一植物或其组织来说,其相应的RNA提取方法必须经过摸索和实践才能确立[1].

目前,有关凤仙花（Impatiens balsamina）花芽发育的分子机制研究已经成为花器官和花对称研究领域的热点,但其总RNA的提取方法报道较少.尽管一些报道表明成功地从凤仙花叶片中提取了总RNA[2-3],但有关凤仙花花芽RNA的提取尚未见报道.基于凤仙花中存在大量的黄酮醇类、萘醌衍生物,以及一些多糖及多酚类物质,特别是花蕾中富含花青素（属于酚类化合物中的类黄酮类）,它们对RNA的分离和纯化均有相当大的干扰[4].因此,寻找合适的方法提取凤仙花花芽RNA是进行凤仙花发育研究的关键之一.

本文以栽培凤仙花品种的花芽为试验材料,同时选取了含酚类和多糖较少的凤尾丝兰（Yucca glariosa）花芽作为对照,比较了Trizol法、改良Trizol法1和2、天根植物总RNA提取试剂盒以及改良CTAB法提取花芽RNA的效果,以期得到切实可行的凤仙花花芽总RNA提取方案,为有关凤仙花花蕾总RNA分子生物学研究奠定基础,同时也为其他相似类型的花芽总RNA提取提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2011年在河南科技学院植物学实验室与中药资源研究所进行.

1.2 试验材料

1.2.1 试验材料 试验材料为新鲜的非洲凤仙花花芽,对照试验用新鲜的栽培凤尾丝兰花芽.

1.2.2 主要试剂 Trizol总RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司；植物总RNA提取试剂盒（RNAprep pure Plant Kit）购自天根公司（TIANGEN）；DEPC（焦碳酸二乙酯）、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）和PVP40000（聚乙烯吡咯烷酮）为索来宝产品；Tris-HCl、EDTA（Na）（2乙二胺四乙酸钠）、琼脂糖、SDS（十二烷基磺酸钠）和β-巯基乙醇为Takara产品；LiC和亚精胺为Sigma产品；其他常用试剂均为进口或国产分析纯.

1.2.3 仪器设备 Mikro-22R台式低温高速离心机（北京中西远大科技有限公司）、Biometra PCR仪（华粤行仪器公司）、Stuart漩涡振荡器（上海美晨生物医学科技有限公司）、DYY-10C电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂）、Bio-Radgel-doc2000凝胶成像系统（美国伯乐公司）、电热恒温水浴锅（江苏金坛市中大仪器厂）、JA5002型电子天平（上海精天电子仪器有限公司）、SW-CJ-1F型单人双面净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、LDZX-50FA型立式电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、电热干燥箱（上海实验仪器厂有限公司）等.

1.2.4 试剂配制及实验准备 2 g/100mL CTAB提取液,20 g/L PVP40000,0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）,9.306 g/L EDTA（Na）（2pH 8.0）,2 mol/L NaCl,0.5 g/L亚精胺；V氯仿∶V异戊醇=24∶1.以上试剂均用0.1%的DEPC处理水（将配置好的DEPC水置于摇床过夜,并于121℃灭菌20 min后得到）配制.

试验中用到的枪头、离心管等塑料耗材均用0.1%的DEPC水浸泡处理过夜,并于121℃灭菌20 min后于烘干箱中70℃烘干备用；镊子、药勺、研钵及研锤均清洗干净、晾干,用锡纸包裹,同量筒、试剂瓶等玻璃器皿一起放置烘干箱经180℃高温烘烤6 h后,用时再取出,以避免RNase的污染.

1.3 花芽RNA提取方法

试验共采用了5种不同的花芽RNA提取方法,分别为：

①Trizol法：摘取凤仙花花蕾0.2 g左右置于研钵中,于超净工作台在液氮将冷冻下充分研磨15～20 min；先取2 mL RNase-free离心管放入液氮中预冷,再将研磨的材料迅速转入离心管中；待液氮挥发完后,按1 mL Trizol试剂/100mg材料的比例加入Trizol试剂,涡旋充分混匀,在室温下倾斜放置30 min；12 000 r/min离心10 min,小心吸取上清液至另一离心管；向上清液加入0.2倍体积的三氯甲烷,并充分混匀,室温放置5 min；12 000 r/min离心10 min,并保留水相,小心吸至另一离心管；向水相加入等体积的异丙醇,并充分混匀后,在-20℃下放置2 h以上；12 000 r/min,4℃,离心30 min,弃上清,并保留沉淀；75%乙醇洗沉淀2次,然后风干沉淀；将沉淀溶解于适量的DEPC-H2O中；电泳检测总RNA的质量.同时用该方法对凤尾丝兰的花蕾做处理.

②改良Trizol法1：摘取凤仙花花蕾0.2 g左右置于研钵中,于超净工作台在液氮下冷冻并充分研磨15～20 min；先取5 mL RNase-free离心管放入液氮中预冷,再将研磨的材料迅速转入离心管中；迅速向离心管中加入已经预先在-20℃冰冷的2 mL丙酮,β-巯基乙醇30 μL,振荡20 min.6 000 r/min离心10 min.弃去上清,加入Trizol试剂2 mL,涡旋充分混匀,在室温下倾斜放置30 min；以下步骤同Trizol法.同时用该方法对凤尾丝兰的花蕾做处理.

③改良Trizol法2：用体积分数为80%的乙醇替代方法2中的丙酮,其余步骤同方法2.

④天根植物总RNA提取试剂盒法：严格按照TIANGEN的RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）的提取操作步骤进行.

⑤改良CTAB法：摘取凤仙花花蕾0.2 g左右置于研钵中,于超净工作台在液氮下冷冻并充分研磨15～20 min；先取5 mL RNase-free离心管放入液氮中预冷,再将研磨的材料迅速转入离心管中；0.1 g样品加入1 mL 65℃预热的CTAB提取液,充分混匀,振荡,65℃水浴10 min,在此期间每3 min颠倒1次；冷却至常温,加入200 μL氯仿异戊醇混合液,充分快速混匀,然后静置在冰上约5 min,等待分层,然后4℃,12 000 r/min离心10 min；取上清于新的离心管中,加入1/4体积的10 mol/L LiCl溶液,混匀,在-20℃下放置2 h（或者冰水浴过夜）.然后4℃,12 000 r/min离心20 min,弃上清；将沉淀用0.5%SDS 500 μL溶解,再加入等体积的氯仿：异戊醇进行抽提.然后4℃,12 000 r/min离心10 min；转移上清至新的离心管中,加入2倍体积预冷在-20℃的无水乙醇,在-20℃下放置30 min.然后4℃,12 000 r/min离心10 min,弃上清；体积分数为75%的乙醇洗涤2次,然后风干沉淀；将沉淀溶解于适量的DEPC-H2O中；电泳检测总RNA的质量.

1.4 总RNA提取质量检测及其浓度测定

取5 μL RNA样品在1%的非变性琼脂糖凝胶上电泳检测,EB（溴化乙锭）染色,电泳缓冲液为1×TAE,200 V稳压电泳7 min,Bio-Rad gel-doc2000凝胶呈像系统拍照记录.取10 μL样品稀释100倍,用紫外分光光度计测定OD260/OD280值.

2 结果与分析

2.1 不同材料不同提取方法获得RNA的电泳检测

5种提取方法所获得的花芽总RNA电泳结果见图1.

图1 不同提取方法的花芽总RNA电泳图谱Fig.1 Electrophoresis map of bud total-RNA by different extraction methods

由图1可知,不同方法所提取的凤尾丝兰花芽总RNA之间具有明显的差异,然而均能够得到相当量的总RNA,尤其以方法2和方法5提取效率最高.相比较方法5,方法2、3、4的电泳结果具有明显的弥散,胶孔部位有残留杂质,并且也有微弱的DNA带出现,因此,在对凤尾丝兰的花芽总RNA的提取中,方法5无疑是最优的方法.不同方法所提取凤仙花花芽RNA之间的差异特别显著,方法1-4的电泳结果表明,除了方法2有较多量的总RNA外,其他方法都只有微弱的产物.同时,尽管方法2的产量尚可,但是其电泳结果弥散且胶孔有杂质残留,说明纯度很可能不高.相比较前4种方法,方法5的电泳条带清晰明亮,28S、18S和5S RNA条带带型清晰,胶孔没有明显的杂质残留.

2.2 不同材料不同方法所提取总RNA纯度的检测

不同提取方法所获得的花芽总RNA纯度检测结果见表1.

表1 不同提取方法所获得花芽总RNA的OD260/OD280值Tab.1 The bud total-RNA OD260/OD280 by different extraction methods

由表1可知,方法1和方法4所获得凤尾丝兰和凤仙花花芽总RNA的OD260/OD280在1.6～1.7之间,方法2和方法3所获得的两个材料总RNA的OD260/OD280在1.5～1.6之间,而方法5所获得两种材料的花芽总RNA的OD260/OD280的值在1.9～2.0之间.方法5所获得的总RNA纯度明显高于方法1-4.

3 结论与讨论

植物含有的多糖、多酚、萜类等化合物会随着组织的研磨、细胞破碎被释放出来并与RNA相互作用,与RNA共同沉淀造成污染,或使RNA降解,增大植物RNA的提取难度[5].凤仙花花蕾中含有大量的黄酮醇类、萘醌衍生物、多糖、酚类以及其他次生代谢产物,抑酚、去糖和去蛋白是凤仙花花蕾RNA提取的关键.

凤仙花花瓣中含有大量的花青素,属于酚类化合物.在细胞破碎后,这些酚类物质会释放出来并被氧化,氧化的酚类化合物能迅速与RNA稳定结合,从而影响RNA的分离和纯化[6].螯合剂PVP可高效结合酚类物质,强还原剂β-巯基乙醇能有效抑制多酚氧化,因此本研究中用β-巯基乙醇和PVP很好地避免了酚类的氧化和流失.

凤仙花是富含多糖的植物,而多糖的许多理化性质与RNA相似,因此很难将它们分开.在去除多糖的同时RNA也很容易被裹携丢失,造成RNA产量的减少；同时,在沉淀RNA时,多糖也会产生凝胶状沉淀[7].利用LiCl可选择性地沉淀RNA去除多糖[2].

Trizol法并不能较好地除去酚类化合物.因此,Trizol法提取含有花青素的凤仙花的花蕾总RNA时,其提取液是紫红色的,而用此方法处理凤尾丝兰的花蕾时却能得到高质量的RNA.这是由于凤尾丝兰不含花青素,也就没有太多酚类物质的干扰.在对Trizol进行改良时,我们通过增加丙酮或乙醇来处理色素,但是在用异丙醇沉淀RNA时看不到白色沉淀,而是透明的凝胶状沉淀,原因可能是多糖的影响,改良后并不能有效地去除多糖,从而使在沉淀RNA时,也产生多糖的凝胶状沉淀,这种含有多糖的RNA沉淀溶解后产生粘稠状的溶液.

天根总RNA提取试剂盒提取凤仙花花蕾总RNA时,电泳检测也无RNA条带,分析原因可能是这种试剂盒中不含有去除类黄酮类物质的成分或者很少.

改良CTAB法成本低,经济节约,提取效率高.虽然该方法操作复杂,容易丢失小片段RNA（这是由于小片段的RNA容易贴到管壁上,可通过洗涤来解决）,但是此法可以从凤仙花花蕾中提取到质量高、完整性好的RNA,提取的RNA能用于后续的分子生物学实验,为凤仙花的分子生物学研究提供良好的基础.同时,也为其他富含多糖、多酚的植物材料总RNA的提取提供借鉴意义.

[1]李宏,王新力.植物组织RNA提取的难点及对策[J].生物技术通报,1999（1）：36-38.

[2]李劲涛,杨军,阳海宁,等.航天诱变凤仙花总RNA的提取及RT-PCR初探[J].生物技术通讯,2007,18（5）：806-808.

[3]郑元仙,李永忠,刘雅婷,等.云南省蝴蝶兰上凤仙花坏死斑病毒的鉴定[J].园艺学报,2010,37（2）：313-318.

[4]胡喜兰,朱慧,刘存瑞,等.凤仙花的化学成分研究[J].中成药,2003,25（10）：833-834.

[5]AinsworthC.IsolationofRNA from floraltissueof Rumex acetosa（Sorrel）[J].PlantMolecularBiologyReporter,1994,12（3）：198-203.

[6]孟丽,周琳,张明姝,等.一种有效的花瓣总 RNA 的提取方法[J].生物技术,2006,16（1）：38-39.

[7]Su X,Gibor A.A method for RNA isolation from marine macro-algae[J].Analytical Biochemistry,1988,174（2）：650-657.