环境因素及COMT基因多态性与乳腺癌关系的病例对照研究

李 君，刘 坤，蒋守芳，陈海燕，袁聚祥，牛凤玲，张国志

（1.湖北文理学院 医学院，湖北 襄阳 441053；2.河北联合大学 公共卫生学院，河北 唐山 063000；3.唐山市肿瘤医院 乳腺外科，河北 唐山 063000；4.河北联合大学附属医院 普外科，河北 唐山 063000）

乳腺癌是最常见严重危害女性健康的恶性肿瘤之一，其发病率目前正逐年增高，位居很多大城市女性肿瘤的第一位，已成为对妇女健康威胁最大的疾病，乳腺癌的发生受到基因遗传易感性和环境因素的双重影响. 以往研究表明，外源性化学物质（有机氯农药等）具有拟雌激素活性，起到内分泌干扰作用，唐山市震后为消毒防疫，于1976及1977两年共使用有机磷农药300余吨，有机氯农药滴滴涕84吨，可湿性六六六粉416吨[1]，而有机氯杀虫剂可长时间残留于环境中，内源性与外源性雌激素是引发乳腺癌的主要危险因素[2]，与雌激素代谢相关基因的多态性，可能会影响雌激素的合成或降解，进而影响乳腺癌发生的危险性. 儿茶酚-O-甲基转移酶(catechol-O- methyltransferase, COMT)是近年发现的与乳腺癌雌激素代谢有关的代谢酶，可通过甲基化使雌激素代谢产物失活[3]，具有基因多态性，不同的基因型其活性也不同，COMT活性的降低会导致雌激素分解代谢能力发生变化，从而可能与乳腺癌的易感性相关. 本研究采用1:1配比的病例对照方法，分析环境因素、COMT基因多态性与乳腺癌的关系，为进一步阐明乳腺癌的病因与发病机制，筛选乳腺癌高危人群，探讨乳腺癌的防治策略提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 研究对象

以2010年10月—2011年10月唐山市5所大医院就诊的新发女性乳腺癌患者120例为病例，所有病例均经病理学确诊，并在唐山本地居住10年以上. 选取与病例同期住院非肿瘤、非生殖内分泌系统疾病女性患者为对照，按年龄差不超过5岁进行1:1配对.

1.2 流行病学调查研究方法

1.2.1 调查方法

本研究根据统一的调查表进行流行病学调查，调查表是参照以往《全国恶性肿瘤危险因素监测资料》调查表，并结合本研究内容自行设计完成的. 调查员由经过培训的人员担任，通过访谈式调查及查阅病历获得调查资料.

1.2.2 调查内容

包括一般特征（年龄、住址、职业、文化程度、身高、体重）、生活方式（吸烟、饮酒、被动吸烟、体育锻炼等）、饮食习惯（猪肉、牛羊肉、腌制食品、油炸食品、蔬菜、水果的食用情况等）、环境暴露（震后农药暴露、职业接触史、居住环境、饮用水、杀虫剂使用情况等）、既往病史及家族史（乳腺病史、家族肿瘤史、其他内分泌疾病史等）、月经生育史（初潮年龄、初产年龄、生育次数、流产次数、月经情况等）、社会心理（精神刺激史、性格、生活满意度等）、地震相关调查（地震家庭伤亡情况、震后情感状况、震后一年内闻到农药气味等）.

1.3 实验检测

1.3.1 主要实验仪器与试剂

PCR扩增仪GeneAmp（PCR2400 PE公司）、凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）、紫外可见分光光度计（Smart spec 3000型，美国Bio-Rad公司）、电泳仪（DYY-8C型，北京六一仪器厂）、低温高速离心机KDC-10 44型（北京医用离心机械厂）、微量加样器（1-1000μL，德国 Eppendorf公司）等.

限制性内切酶NlaⅢ（纽英伦生物技术（北京）有限公司）、2×Taq PCR MasterMix（北京艾德莱生物科技有限公司）、蛋白酶K（华美生物工程公司）、吐温-100（Tween-100，华美生物工程公司）、三羟甲基氨基甲烷（Tris，Amresco公司）、乙二酰四乙酸二钠（EDTA，Amresco公司）、PCR Marker（北京艾德莱生物科技有限公司）、溴乙锭（EB，华美生物工程公司）等.

1.3.2 血液样本的采集及检测

病例及对照均采集清晨空腹抗凝静脉血液5ml，-20℃冰箱冻存，待测.

盐析法提取 DNA 取血样 2ml移至 15ml离心管中，加入溶血试剂 5-6ml，混匀放置 10min；3500r/min离心30min后，弃上清；加入溶血试剂至5-6ml，用吹管吹开底部固体，放置10min；3500r/min离心30min后，弃上清；离心步骤共重复3-4遍，洗至粉红色为止. 倒出上清后，底部固体加入0.25ml核悬浮液，用枪头吹散；加入5μl蛋白酶K和12ul 10%SDS混匀，37℃水浴6h或过夜. 加0.15ml 6mol/L NaCl，混匀，4℃放置 20min；2800r/min离心 25min；将上清液移至 EP管中；向 EP管中加入 1ml预冷的无水乙醇，轻轻搅动至絮状DNA析出为止，-20℃放置15-20min；3500 r/min离心10min后，弃上清，用95%乙醇醇洗1次，70%乙醇醇洗2次，弃上清，干燥；加入50μl TBE，-20℃保存.

COMT基因的扩增 PCR扩增反应体系为25μl：Master Mix 12.5μl，上、下游引物各1μl，DNA 2μl，加灭菌水至25μl后混匀. PCR反应条件：94℃预变性3min，接着按94℃ 1min、60℃ 30s、72℃ 30s共循环35次，最后72℃延长10min. 电泳：制内含EB 3μg/ml的1.8%的琼脂糖凝胶，取扩增产物2μl，加少量上样缓冲液，120V电压条件下电泳10min，于凝胶成像系统下观察，若样品在于PCR Marker相对应位置出现条带，则为有扩增产物，对扩增产物进行酶切.

限制性内切酶 NlaⅢ鉴别 COMT基因多态性 反应体系 20μl：包括 DNA15μl，限制性内切酶NlaⅢ 0.5μl (10U/μl)，10×NEB 2μl，100×BSA 0.2μl，双蒸水 2.3μl. 反应条件：37℃，3h 恒温孵育. 电泳后将胶移至凝胶成像系统下观察结果：根据条带数（与Marker对照）确定基因型，观察产物高活性基因型（COMT GG）酶切产物可见到114bp的片段，低活性基因型（COMT AA）可见到96bp的判断，而杂合子（COMT GA）则可同时出现114bp及96bp的片段.

1.4 质量控制

现场调查质量控制：采用1:1配对的病例对照研究，以混杂因素作为匹配条件，控制混杂因素影响. 严格按照病例对照筛选标准，尽可能从多个医院选取病例，从多科室多病种选择对照，进而控制选择偏倚. 查阅大量文献，制定尽可能全面、具体的调查表，变量最好为可以量化的客观指标. 病例与对照调查表及调查环境应一致. 培训调查员，掌握调查的目的、意义和调查数据的收集方式、询问语气和技巧等. 以5%的比例对调查表进行抽查，对发现的错项和漏项进行及时的修改和补填，抽查合格率达到95%以上，进而控制信息偏倚.

1.5 统计学分析

用Excel建立数据库，用SPSS16.0软件进行统计分析，病例与对照基本情况及COMT基因多态性分析的采用配对t检验或卡方检验，采用单因素条件Logistic回归和多因素条件Logistic回归模型分析乳腺癌的危险因素.

2 结果

2.1 一般情况

本次研究共调查1:1配对的病例和对照120对，其中病例平均年龄50.57±9.50岁，对照平均年龄50.72±9.90岁，病例和对照间年龄比较差异无统计学意义(t=0.09，P=0.93)；病例120人的婚姻状况均为已婚，对照中2人未婚，其余118人为已婚. 对研究对象中病例与对照进行职业、居住地分布、文化程度比较，结果显示病例和对照人口学特征均衡可比.

2.2 环境危险因素与乳腺癌的关系

为控制其他因素对乳腺癌的影响，首先进行目前公认的乳腺癌危险因素分析，并将其中有意义的因素作为调整控制因素后，进行环境危险因素与乳腺癌关系的分析.

2.2.1 月经生育因素、心理因素、既往病史与家族史与乳腺癌的关系

采用条件Logistic分析，分析月经生育因素、心理因素、既往病史与家族史与乳腺癌关系，见表1.

表1 月经生育因素、心理因素、既往病史及家族史与乳腺癌关系的单因素条件Logistic回归分析

续表1

结果显示痛经、做过流产、有工作或生活压力、经历过负性事件、A型性格和爱生气、乳腺病史、生殖系统疾病史、其他病史、肿瘤家族史、一级亲属患乳腺癌为乳腺癌的危险因素.

2.2.2 饮食习惯、生活方式因素与乳腺癌的关系

进一步将月经生育因素和社会心理因素及家族史分析中有意义的因素作为调整因素，进行饮食习惯及生活方式因素与乳腺癌关系的分析，由表2可见，被动吸烟≥10年（OR=6.41，95%CI：3.08～13.34）为乳腺癌的危险因素；豆类摄入多（OR=0.29，95%CI：0.14～0.62），高纤维素饮食（OR=0.23，95%CI：0.10～0.52）为乳腺癌的保护因素.

表2 饮食习惯、生活方式与乳腺癌关系的单因素条件Logistic回归分析

2.2.3 生活环境暴露因素与乳腺癌的关系

生活环境暴露因素的单因素条件Logistic回归分析结果见表3，经月经生育因素和社会心理因素及家族史调整后乳腺癌的环境危险因素有：居住地环境污染、室内杀虫剂使用≥5年、职业接触及农药使用≥10年，烹调使用排油烟设备、地震后一年内很少闻到农药气味为保护因素.

2.2.4 乳腺癌环境危险因素的多因素Logistic回归分析

为了控制各个因素之间的混杂影响效应，将以上单因素分析有意义的危险因素纳入多因素条件Logistic回归模型，分析结果由表4所示：居住地环境污染（OR=13.17），被动吸烟≥10年（OR=17.80），农药使用≥10年（OR=5.66）为乳腺癌危险因素. 地震后一年内很少闻到农药气味（OR=0.10），烹调时使用排油设备（OR=0.16）为保护因素.

表3 环境暴露因素与乳腺癌关系的的单因素条件Logistic回归分析

表4 女性乳腺癌环境因素的多因素条件Logistic回归分析

3 COMT基因多态性与乳腺癌的关系

3.1 COMT基因多态性电泳结果

共检测120对病例与对照的COMT基因多态性. PCR扩增产物经NlaⅢ酶切后，呈现三种基因型. 纯合野生型GG位于第2泳道；杂合基因型GA位于第1、4泳道；纯合突变基因型AA位于第3泳道，见图1.

图1 NlaⅢ酶切电泳图

3.2 病例与对照COMT基因型的分布

由表 5可见，病例和对照基因型频率分布差异有统计学意义(χ2=8.28，P＜0.05)，基因型位点至少携带一个突变等位基因（杂合型GA和突变纯合型AA）的为易感基因型，野生纯合型GG为参照基因型，结果提示，病例与对照野生型杂合子基因型分布和突变型纯合子分布频率差异均有统计学意义（OR=1.79，95%CI：0.57～5.56；OR=1.15，95%CI：0.35～3.85），即携带杂合型和突变纯合型者患乳腺癌的风险分别为野生纯合型的1.79和1.15倍.

表5 病例和对照COMT基因型的分布比较

4 讨论

病因学探索揭示乳腺癌发病与许多因素相关，包括遗传／家族因素、生殖／内分泌因素、生活／行为因素和环境因素等[4]，国内外学者对于前三类因素进行了广泛的研究，本研究在分析了月经生育史、社会心理因素、既往病史及家族史与乳腺癌的关系后，采用统计分析方法对这些因素进行了控制，着重探讨环境危险因素与乳腺癌的关系.

4.1 饮食习惯、生活方式因素与乳腺癌的关系

有调查研究发现，长期食用高脂肪、高蛋白膳食、单不饱和脂肪酸摄入过高及肥胖均为乳腺癌发病的危险因素，但膳食脂肪与乳腺癌的相关性研究结果也存在不一致. 本研究结果显示：豆类摄入多，高纤维素饮食为保护因素，这与大多文献结果还是一致的[5-7].

有研究认为吸烟有致癌作用，但由于国内女性吸烟者较少，因此把吸烟划分为主动吸烟和被动吸烟，被动吸烟女性长期吸入烟雾中的致癌物质，对乳腺癌发生起到诱发和促进作用. 本次研究结果提示被动吸烟≥10年为乳腺癌的危险因素（OR=17.80，95%CI：4.04～78.47），即被动吸烟≥10年患乳腺癌的危险性是被动吸烟＜10年的17.80倍，这与相关文献研究结果一致[8].

4.2 生活环境暴露因素与乳腺癌的关系

随着工业化进程的加快，环境污染日益加重，环境污染物中的环境内分泌干扰物（如农药、去污剂等）、化学致癌物与乳腺癌的关联引起了人们的广泛关注. 本次研究结果经月经生育因素和社会心理因素及家族史调整后，进一步进行多因素条件Logistic回归分析. 结果显示，居住地环境污染、农药使用≥10年、被动吸烟≥10年为乳腺癌危险因素. 而烹调时使用排油设备、豆类摄入多则为保护因素. 这与以往大多数研究结果一致.

4.3 COMT基因多态性与乳腺癌的关系

COMT基因编码的儿茶酚-O-甲基转移酶是雌激素生物代谢阶段Ⅱ过程中一个重要的功能酶，能通过甲基化使儿茶酚雌激素失活，使其结合受体的能力降低，因此COMT在乳腺癌的发生和进展中作用不容忽视.COMT基因在第4号外显子存在1个G与A的置换点突变，使其编码的108或158位氨基酸由缬氨酸被甲硫氨酸取代(Val→Met)，导致活性改变. 当其158位氨基酸为Met时，该酶变为不耐热，在生理条件下，其活性也大大降低. COMT活性具3个峰值分布：AA-低活性COMT基因型，AG-中等活性COMT基因型，GG-高活性COMT基因型. 低活性COMT(AA)基因编码的酶活性比高活性COMT(GG)基因编码的酶活性低3或4倍. 如果COMT活性较低，则会导致雌二醇4-羟化产物增多，从而增加肿瘤发生的风险.

近年来，国内、外学者对COMT基因多态性给与了很多关注，其中COMT基因多态性与乳腺癌有关是近年来才发现的，国内有关研究还很少，国外虽有一些研究，但结果尚不一致. Matsui[9]等对140例乳腺癌患者研究认为基因型与乳腺癌临床分期及癌细胞在淋巴系统的扩散有关. 谭文[10]等研究显示乳腺癌患者的AA基因型频率为10.4%，显著高于对照组5.2%，差异有统计学意义(P=0.03). 本研究对120对病例与对照进行了基因型的检测，GG、GA、AA基因型频率病例组分别为60.8%、35.0%、4.2%，对照组分别为48.3%、37.5%、14.2%，结果提示，乳腺癌患者 COMT基因型 AA（158Met）的分布频率显著高于对照组，低活性等位基因型可能与乳腺癌的发生有关（OR=1.15；95%CI：0.35～3.85）（P=0.04）.

乳腺癌的发生病因复杂，人群的环境暴露是多因素长期低剂量复合作用，环境因素暴露评价存在一定难度，因此研究结果可能存在一定的局限性，需要在不同的人群中进行验证. 当暴露水平较低或易感基因型频率较低时，研究环境因素与易感基因间关系时需要扩大样本量来验证结论[11].

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