发酵食品中氨基甲酸乙酯污染状况调查与分析

龙顺荣，周勇，郦明浩，谭锦萍，杨晓云

1(广东产品质量监督检验研究院，广东广州，510330)2(华南农业大学资源环境学院，广东广州，510642)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)存在于饮料酒、焙烤食品、调味品等发酵食品中，是发酵过程副产物，早在1943年被Nettleship证实为一种多位点致癌物，会导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病［1－2］，并影响人体免疫系统，乙醇对EC的致癌性有促进作用［3－4］，2007 年国际癌症研究机构(IARC)指出，EC对人类的致癌毒性为2A群［5］。1985年加拿大最先规定酒中EC限量，随后美、德、法、韩等国都相应规定EC含量限值，2002年联合国粮农组织(FAO)将EC列为重点监控物质，并制定国际标准，我国已经制定饮料酒中EC的检测标准，但没有制定发酵食品EC的限值［6－15］。本研究采用液液萃取和基质固相分散的样品前处理技术，应用气相色谱-串联质谱的检测方法，开展流通领域发酵食品中EC的污染状况调查，为发酵食品中EC的风险评估和制定限值提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本研究的样品来源于流通领域，主要分析流通领域中饮料酒、焙烤食品和调味品中EC的污染状况，共采集发酵食品437批次，其中62批次葡萄酒，37批次黄酒，3批次果酒，4批次啤酒，73批次蒸馏酒，45批次配制酒，109批次酱油，75批次醋，29批次面包。

1.2 仪器与试剂

Agilent 7000A三重四级杆气相色谱-串联质谱仪:配有Agilent Masshunter化学工作站，美国安捷伦公司;Eyela SB-1100旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司;Milli-Q超纯水器，美国Millipore公司;Sigma 3－18K高速离心机，德国SIGMA公司;DC-12氮吹仪，上海安谱科学仪器有限公司。

二氯甲烷、正己烷、无水Na2SO4、活性炭、NaCl:分析纯，广州化学试剂厂;硅藻土:化学纯，广州市产品质量检验技术开发公司进口分装;硅胶:60～100目，国药集团化学试剂有限公司;氨基甲酸乙酯标准品:≥99%，美国Sigma-Aldrich公司。

1.3 气相色谱-串联质谱条件

色谱条件:毛细管柱DB-225MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm，进样口温度 230℃，氦气流速 1.0 mL/min，不分流，初始温度50℃保持1 min，以8℃/min升至120℃，以40℃/min升至230℃保持10 min。

质谱条件:EI离子源温度300℃，传输线温度230℃，溶剂延迟8 min，碰撞气:氦气1.5 mL/min、氮气2.25 mL/min，碰撞能量25eV;采用MRM方式进行定性定量，母离子m/z 62，定量离子m/z 44，定性离子m/z 45。

1.4 标准储备液和标准系列溶液配制

称取适量的氨基甲酸乙酯标准品于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷稀释定容，使该溶液每毫升含氨基甲酸乙酯1 mg，冷藏于冰箱中，有效期2个月。分别吸取适量的氨基甲酸乙酯标准贮备液于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，配成 10 μg/L，50 μg/L，100 μg/L，250 μg/L，500 μg/L，1 000 μg/L 标准工作曲线。

1.5 样品处理

1.5.1 饮料酒

取20.0 mL酒于150 mL分液漏斗中，加入20 mL水和适量NaCl使样品达到饱和，再加20 mL正己烷，振摇5 min，静置分层后用吸管吸出正己烷层，弃去，然后用50 mL×3次二氯甲烷萃取，振摇5 min，合并有机相过无水Na2SO4，浓缩至3 mL左右，转入10 mL刻度试管中，用少量二氯甲烷洗涤浓缩瓶2至3次，洗涤液转入试管中，氮吹，定容至5.0 mL，过滤上机。

1.5.2 焙烤食品、调味品

取5.0 g样品于装有10 g硅藻土∶无水Na2SO4(1∶1)的研钵中研匀。向玻璃层析柱中依次加入1 cm无水Na2SO4、0.5 g 10%活性炭硅胶、1 cm无水Na2SO4、样品、2 cm无水Na2SO4。打开层析柱活塞，加入40 mL正己烷洗脱非极性成分，流速控制为8 mL/min，弃去流出液，加入100 mL二氯甲烷洗脱，流速最大时收集洗脱液，浓缩至3 mL左右，转入10 mL刻度试管中，用少量二氯甲烷洗涤浓缩瓶2至3次，洗涤液转入试管中，氮吹，定容至5.0 mL，过滤上机。

2 结果与分析

2.1 标准曲线和方法检出限

以EC的子离子m/z 44峰面积与其对应浓度作线性回归，得标准曲线为y=21.8922x－75.2654，相关系数r=0.9995，EC在10～1 000 μg/L范围内具有良好的线性关系，说明本方法可以对发酵食品中EC进行准确的定性定量分析，以标准品在仪器上最低可检出的浓度代入前处理过程中计算饮料酒中EC方法检出限为1.0 μg/L，焙烤食品和调味品为5.0 μg/kg。

2.2 方法回收率及精密度

选取EC含量较低的样品为基底样品，根据方法检出限和样品实际检出范围，进行不同浓度加标回收实验，每类样品按照1.5的方法进行样品前处理，平行测定5次，按照1.3小节的条件测定EC的含量并计算样品回收率及其平均值和相对标准偏差，具体结果见表1。

表1 回收率和精密度测定结果(n=5)Table 1 Determination results of recovery and precision(n=5)

2.3 样品处理

饮料酒前处理静置后若二氯甲烷和水层不能分离，出现乳化严重现象，可以先将样品转入离心管中离心分层，再缓缓转入分液漏斗中。焙烤食品、调味品前处理仅仅以硅藻土为吸附剂，以二氯甲烷为洗脱剂，则洗脱剂的用量比较大，且洗脱下来的油脂、色素和其他杂质较多，以1∶1的硅藻土－无水Na2SO4为吸附剂，可以达到吸附效果，并且在玻璃层析柱中占用体积小，使得洗脱剂的用量减少而降低其它杂质，用10%活性炭硅胶不但可以吸附色素，也可以吸附杂质。由于氨基甲酸乙酯具有升华的性质，样品浓缩和氮吹时水浴温度不要超过40℃，不能浓缩或者氮吹干，浓缩和氮吹时溶液体积不要少于3 mL，否则会影响氨基甲酸乙酯的回收率。

2.4 样品中EC污染状况

本研究样品来源于广东省流通领域，基本上涵盖了主要的发酵食品分布情况，具有良好的代表性，本研究共监测437批次发酵食品，其中阳性样品343批次，阳性率为78.49%，具体情况见表2。

共监测224批次饮料酒，各类饮料酒中EC平均值从高到低依次为黄酒、保健酒、果酒、高粱酒、米酒、料酒、双蒸酒和葡萄酒，其中最高黄酒为90.4 μg/L，其次为保健酒62.9 μg/L，最低葡萄酒为7.6 μg/L;按食品类别统计含量最大值，最高值为保健酒255.1 μg/L，其次为黄酒228.2 μg/L，最低值为双蒸酒17.2 μg/L;按照阳性率统计，最高为果酒100%，其次是黄酒78.38%，最低为啤酒未检出 EC。对照加拿大1985年制定的葡萄酒EC限值(30 μg/L)，葡萄酒超标率为1.6%(1/62)，对照加拿大日本清酒EC限值(200 μg/L)，黄酒超标率为 5.4%(2/37)，对照加拿大蒸馏烈酒EC限值(150 μg/L)，保健酒超标率为7.1%(2/28)，其它饮料酒均低于限值要求。表2数据说明黄酒和保健酒中EC含量的平均值和超标率较高，其原因跟黄酒、保健酒的酿造与存储有关，饮料酒中EC主要来源是尿素和乙醇反应生成，黄酒和保健酒在煎酒过程中由于工艺需要高温提高其稳定性，造成尿素和乙醇加速反应，形成更多EC，同时保健酒需要长时间的浸泡(提取保健材料中的有效成分)、黄酒也需要长时间窖藏，使酒液中的尿素和乙醇继续反应，造成成品中EC含量偏高。

表2 不同发酵食品中氨基甲酸乙酯污染状况Table 2 Residue levels of ethyl carbamate in different fermented foods

共监测184批次的调味品，酱油和醋中EC平均值分别为 84.1 μg/kg、76.2 μg/kg，中位值分别为76.3 μg/kg、52.3 μg/kg，阳性率分别为 98.17% 和86.67%，以上数据表明酱油和醋中EC的含量高并且检出率高，需要重点地监测和关注。共监测29批次的焙烤食品，面包中EC平均值为24.3 μg/kg，中位值为22.2 μg/kg，阳性率为72.41%。目前对饮料酒中EC的形成机理研究较多，而对酱油、醋、面包等其它发酵食品的形成机理研究非常少，其氨基甲酸乙酯的形成机理还需要进一步研究。

3 结论

本研究结果表明，大部分发酵食品均存在EC的污染，平均含量最高的是黄酒，其次是酱油和醋，同时酱油和醋中EC的阳性率也相对较高，在今后的研究和检测中需要重点关注。以上数据为我国发酵食品中EC的安全性评估提供了基础数据支持。

［1］ Nettlsship A，Henshaw P S，Meyer H I.Induction of pulmonary tumors in mice with ethyl carbamate(urethane)［J］.Natal Cancer Inst，1943，4:309 －319.

［2］ Weber J V，Sharypov V I.Ethyl carbamate in foods and beverages:a review［J］.Environ Chem Lett，2009，7(3):233－247.

［3］ Beland F A，Benson W R，Mellick P W，et al.Effect of ethanol on the tumoriginity of urethane(ethyl carbamate)in B6C3F1 mice［J］.Food Chem Technol，2005，43(1):1 －19.

［4］ Miller Y E，Dwyer N，Keith R L，et al.Induction of a high incidence of lung tumors in C57BL/6 mice with multiple ethyl carbamate injection［J］.Cancer Letters，2003，198(2):139－144.

［5］ IARC.Alcoholic beverage consumption and ethyl carbamate(urethane)［M］.International Agency for Research Volume 96.Geneva:World Health Organization，2007

［6］ 吴世嘉，王洪新.发酵食品中氨基甲酸乙酯的研究进展［J］.化学与生物工程，2009，26(9):15－19.

［7］ 于英，李记明，沈志毅，等.葡萄酒中氨基甲酸乙酯的含量测定及酿造工艺对其含量的影响［J］.食品与发酵工业，2012，38(1):152 －154.

［8］ 王立媛，吴平古，张晶，等.酱油中氨基甲酸乙酯和氯丙醇含量调查与分析［J］.中国卫生检验杂志，2012，22(10):2 493－2 495.

［9］ 中华人民共和国浙江进出口商品检验局.SN0285－1993出口酒类中氨基甲酸乙酯残留量检测方法［S］.北京:中国标准出版社，1993

［10］ 程伟，温凯，冯霖，等.我国黄酒中氨基甲酸乙酯含量调查与分析［J］.标准科学，2012(10):62－64.

［11］ Pozobayon M A，Monagas M，Bartolome B，et al.Wine features related to safety and consumer health:an integrated perspective［J］.Crit Rev Food Sci，2012，52(1):31 －54.

［12］ Liu Y P，Dong B，Qin Z S，et al.Ethyl carbamate levels in wine and spirits from markets in Hebei Province，China［J］.Food Addit Contam B，2011，4(1):1 －5.

［13］ 刘晓毅，刘艳琴，赵玉琪，等.酱油中的氨基甲酸乙酯检测方法研究［J］.中国调味品，2010，35(1):81－84.

［14］ 谭波涛，郝媛媛，赵杰，等.GC-MS法测定发酵食品中氨基甲酸乙酯的含量［J］.分析实验室，2011，30(12):31－33.

［15］ 谭文渊，袁东，付大友，等.气相色谱-质谱联用测定白酒中的氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯［J］.食品科学，2011，32(16):305 －307.