S-腺苷蛋氨酸对微生物次生代谢产物的调控作用与机制研究进展*

孙丽慧，张国海，李明刚，郑裕国

(浙江工业大学生物工程研究所，浙江 杭州，310032)

S-腺苷蛋氨酸，又称S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)，化学名称为 5'-［［(3S)-3-氨基-3羧基-丙基］甲基-(S)-砜］-5'-脱氧腺苷，分子式为C16H22N6O5S，分子量为 399［1］。SAM 是双手性分子，具有两种异构体:(R，S)-SAM 和(S，S)-SAM，只有后者在生物体内才具有生物活性。SAM广泛存在于各种生物体的组织和体液中，是仅次于ATP的第二大广泛使用的酶的底物，能够参与各种各样的生化反应［2］。SAM是由S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase)［EC 2.5.1.6］催化甲硫氨酸和ATP反应生成的，ATP上的腺苷部分进攻甲硫氨酸上的 S原子，生成高能量、活泼的有机硫化合物［1］。该反应具有立体专一性，并且在硫原子上只形成一个S构型。SAM作为生物体代谢过程中的甲基供体角色早已为人们所熟知，此外，SAM还起着转硫基、转氨基、转氨丙基和转核糖基的作用［2］。然而近年来，有很多文献报道了在发酵培养基中额外添加SAM或过量表达SAM合成酶基因可以明显促进多种微生物次生代谢产物的合成，并发现SAM对某些微生物细胞的生理分化具有一定影响。因此，本文主要就SAM调节微生物次生代谢及其调控机制做一阐述。

1 生物体内SAM的循环途径及相关酶和基因

当SAM在作为辅因子提供甲基的时候，它被转化成 S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)，随后，SAH又能进入SAM循环过程重新生成SAM［2］。在哺乳动物中，这种循环起始于SAH在腺苷高半胱氨酸酶的作用下被水解释放出腺苷变为同型半胱氨酸(图1，PathwayⅠ)。但在大多数微生物细胞内，这一过程有着明显不同，SAM循环起始于SAH，在腺苷高半胱氨酸酶的作用下先被水解成S-核糖高半胱氨酸(S-ribosylhomocysteine，SRH)，此酶在芽孢杆菌中由mtn基因编码，在大肠杆菌中由pfs基因编码，然后SRH被由luxS基因编码的裂解酶催化生成同型半胱氨酸［3］(图1，PathwayⅡ)。然而比较特殊的是，在链霉菌属中，这一过程却不同于其他微生物，反而近似于哺乳动物中的代谢途径。通过对Streptomyces coellicolor、S.avermitilis和 S.griseus的基因组进行分析，发现了与SAM代谢相关基因sahH的存在，却没有一个与上述提到的mtn或luxS相似［4－5］;这与在 Corynebacterium glutamicum 和 Mycobacterium tuberculosis中的发现相吻合，两者与链霉菌都是属于放线菌，而且胞内也都存在腺苷高半胱氨酸酶;3种链霉菌基因组都包含了metH，metK，metF和adoK，AdoK的序列与Mycobacterium tuberculosis中已经得到功能鉴定的腺苷激酶的序列非常相似［6］，所有这些基因都像初级代谢产物基因一样分散在链霉菌基因组的不同地方。然后同型半胱氨酸在甲硫氨酸合成酶的作用下从甲基-四氢叶酸酯(methyl-THF)上获得一个甲基生成甲硫氨酸(methionine);在大肠杆菌中存在2种甲硫氨酸合成酶，一种是由metH编码的依赖VB12的酶蛋白MetH，另一种酶MetE则不需要VB12作为辅因子，但前者催化的反应速率是后者的100倍以上［7］。代谢反应中的甲基-四氢叶酸酯是由甲硫氨酸-四氢叶酸酯还原得到的，反应由metF编码的蛋白所催化。SAH在水解成同型半胱氨酸的过程中释放出的腺苷能在腺苷激酶的作用下转化成ATP，甲硫氨酸形成以后又能与ATP重新生成SAM，这样便形成了一个“SAM循环”，如图1所示。

图1 SAM在生物体内的合成及代谢途径Fig.1 Synthesis and metabolic pathways of S-adenosylmethionine in organism

在此循环过程中，同型半胱氨酸能通过另一条途径依次生成半胱氨酸和谷胱甘肽(GSH)，该途径起始于同型半胱氨酸与丝氨酸(serine)在胱硫醚β-合成酶的催化下反应生成胱硫醚(cystathionine)。Hansen等［8］发现cys4(编码胱硫醚 β-合成酶)突变株在以甲硫氨酸为硫源时，细胞内的SAM含量要高于正常菌株，因此，要提高细胞内的SAM的积累，除了可以通过过量表达腺苷蛋氨酸合成酶基因metK，还可以通过敲除cys4这一基因，阻断形成半胱氨酸和谷胱甘肽这条途径。

近年来，Haagen 等［9］在 S.cinnamonensis的混源萜类合成基因簇中发现一组连续的5个基因，fnq12-fnq16，与SAM循环的相关基因序列非常相似，这是首次发现这些基因位于一个单独的基因位点。回顾以前的研究发现在S.rochei中兰卡霉素基因簇以及S.lavendulae中番红霉素基因簇中同样有类似基因组的存在，在3种基因簇中，SAM循环的5个基因的排列方向一致，可能形成了一个单独的操纵子，但是还没有相关的实验数据来证明这些基因的具体功能［10－11］。

2 SAM对微生物次生代谢的调控作用

微生物次生代谢产物的合成都会在不同程度上受到一些小分子的调控，这些小分子在生物合成的启动过程中起着非常重要的作用。例如，A因子(第一个被发现的γ-丁酸内酯)和它的同系物VBs在10－9 mol/L的低浓度下就可对S.griseus和S.virginiae合成抗生素的过程具有调控作用［12］;ppGpp被认为是在S.griseus和 S.coelicolor中存在的一种与营养限制相结合的复合调控系统［13］;也有报道关于cAMP在S.coelicolor和 S.fradiae合成抗生素中起着正调控作用［14］。由于SAM是生物体内重要的生理活性物质和中间代谢物质，具有广泛的生物学功能，细胞内SAM浓度微小的变化，就可以对细胞生长、代谢产物的合成以及细胞分化产生较大的影响，因此，外源少量添加SAM或过量表达SAM合成酶基因，都可能会影响微生物次生代谢产物的产量。近年来，SAM对微生物次生代谢产物的调控作用也是众多学者研究的热点。

在放线菌紫素(actinorhodin)高产菌株S.coelicolor KO-179中研究发现，一个46 kDa的蛋白表达量非常高，这个蛋白被鉴定为SAM合成酶，是metK基因的表达产物，将包含metK基因的高拷贝质粒导入野生型细胞后会导致放线菌紫素的提早剧增;进一步研究发现，向培养基中加入SAM，也可以诱导野生型菌株中放线菌紫素的合成［15］。此后又陆续发现在培养基中外源加入适量的SAM还能导致S.griseus中链霉素和S.griseoflavus中二环霉素(bicozamycin)、普那霉素Ⅱ-B(pristinamycinⅡ-B)、榴菌素(granaticin)、竹桃霉素(oleandomycin)和阿弗菌素Bla(avermectin Bla)的过量合成，尤其是当加入1 mmol/L SAM，竹桃霉素和阿弗菌素Bla的产量能分别提高5倍和6倍。这些发现充分说明了胞内的SAM明显对链霉菌属中次生代谢产物的合成起到了重要的调控作用。近年来，越来越多的学者致力于研究关于额外添加适量SAM或过量表达SAM合成酶来促进微生物次生代谢产物的合成，总结如表1。

表1 额外加入SAM或过量表达SAM合成酶对微生物次生代谢产物产量的影响Table 1 Effect of external SAM addition or overexpression of SAM synthetase on the production of secondary metabolites reported in previous studies

2006 年，Yoon 等［16］在 S.avermitilis NRRL8165中发现一个能编码402个氨基酸(约43.5 kDa)的蛋白基因，氨基酸序列分析结果显示其与来自其他链霉菌属中的SAM合成酶的基因序列有84%～93%的相似性，其中包含SAM合成酶的保守序列部分，例如与ATP结合的位点276GGGAFSGKD284(P环)，还有金属离子结合位点(17D和289D结合镁离子，49G结合钾离子)。生物学实验发现，从转导的E.coli中分离出来的蛋白能将ATP和L-Met合成为SAM，证实了该基因确实是编码SAM合成酶的基因;该基因的过量表达可使S.avermitilis中阿弗菌素产量增加了两倍，S.peucetius中阿得利亚霉素(doxorubicin)产量增加了 3.5倍。Wang等［17］将来自 S.spectabilis的metK整合到Saccharopolyspora.erythraea E2的染色体中，重组菌中SAM的含量约提高了2倍，结果导致红霉素(erythromycin)的发酵单位从920 IU/mL提高到2 000 IU/mL，其中主要成份红霉素A的产量相比原始菌株有132%的提高，而杂质组分红霉素B却降低了30%。将metK基因分别导入到S.actuosus和大肠杆菌中，同样导致了诺肽菌素(nosiheptide)和6-deoxyerythronolide B(6-dEB)的产量分别提高了1.8倍和 1.9 倍［18－19］。

另外，Zhao等［20］发现额外加入SAM不影响新生霉素(novobiocin)的合成，但是过度表达SAM合成酶fnq12(来自 S.cinnamonensis)，可以将 S.coelicolor M512胞内的SAM含量增加62%，同时也能促进新生霉素的形成;此外他们还克隆了其中的一个包含了SAM循环过程中需要的5个假设基因操纵子(fnq12-fnq16)到一个表达质粒pSAMXZ06中，期望发挥SAM更好的促进效果，结果发现质粒的导入并没有促进新生霉素的合成，相反还减少了产物的累积(不到对照组的4%)，且细胞生长到稳定期后，培养基颜色开始变黑，细胞数量显著减少，且胞内的SAM含量在对数生长期末达到85μmol/kg，比单独表达SAM合成酶的含量要低。

从表1中可以看出提高微生物细胞内SAM的浓度的确对很多抗生素的合成都有一定的促进作用，但多数情况下，目标代谢产物的产量增加幅度一般不超过2倍，只有少数抗生素的产量有极大程度的提高。SAM不仅能促进许多次生代谢产物的合成，还能影响细胞生理上的分化。Kim等［15］从S.spectabilis中分离出SAM合成酶基因，该基因在S.lividans TK23的过度表达在促进放线菌紫素合成的同时还抑制了其孢子形成和气生菌丝的形成;同样的孢子抑制现象还发生当metK在Saccharopolyspora erythraea E2中过度表达促进红霉素合成时［17］;这些研究证实了SAM在链霉菌属细胞分化过程中也起着一定的影响作用。

3 SAM对微生物次生代谢产物合成的调控机制

3.1 SAM作为甲基供体

尽管对SAM调控微生物次生代谢产物合成的研究仅仅才十多年的时间，但由于其明显的调控作用，引起了众多学者的研究兴趣，使得众多学者逐渐对其代谢调控机制进行了研究。Huh等［14］研究了SAM对四种链霉菌代谢产生多种抗生素合成的影响，并与SAM去甲基后形成的SAH作对比，以此来判断SAM促进抗生素合成是否依赖SAM的甲基供体作用。结果表明，普那霉素Ⅱ-B和榴菌素在合成过程中不需要依赖SAM提供甲基，当分别加入50和10 μM的SAM时，各自产量都增加了约2倍;而竹桃霉素和阿弗菌素Bla合成过程中需要SAM作为甲基供体，当加入合适浓度的SAM时能使其产量分别增加5倍和6倍。当培养基中加入一种甲基转移酶抑制剂西尼霉素(sinefungin)时，竹桃霉素和阿弗菌素 Bla的产量会降低，但是当同时加入SAM和西尼霉素时，其产量又能恢复到正常水平;而西尼霉素对普那霉素II-B和榴菌素的合成没有影响;更有趣的是SAM去甲基以后的产物SAH同样对这四种抗生素的合成有促进作用。这说明SAM在普那霉素II-B和榴菌素的合成中不是作为甲基供体而是作为一种信号分子起到了促进作用;而SAM在竹桃霉素和阿弗菌素Bla的合成中可能是既作为一种胞内信号分子又作为甲基供体，在低含量时(10～50 μmol/L)，SAM 作为信号分子结合微生物次生代谢产物合成途径中的某些调节因子，高含量时可能作为辅因子，因此导致了抗生素产量的显著提高。

3.2 SAM作为信号分子促进关键调节因子的转录

当SAM作为一种信号分子的时候，往往能促进代谢中某些专一途径关键调节因子的转录，进而促进微生物次生代谢产物的合成。例如，过度表达SAM合成酶基因metK能促进S.griseus中actII-ORF4的转录，而它是放线菌紫素合成基因簇中的转录激活子;适量SAM的加入在促进链霉素合成的同时，还使得strR(链霉素合成基因簇中的调节基因)的转录量增加了1.35倍，链霉素激酶的活性也有1.9倍的增加［21］;类似的情况还发生在当10 μM SAM被加入到S.violaceoruber Tu22的培养基中时，专一途径调节因子gra-ORF9的转录量在48h明显增加。然而，SAM作为信号分子时，其信号的传递途径还仍然不清楚。

3.3 SAM作为信号分子与A因子系统相关的调控

到目前为止，SAM对次生代谢产物的促进作用大多发生在链霉菌属合成抗生素的过程中。众所周知，链霉素的合成还受到A因子的调节，在S.griseus中，strR的转录受到AdpA的抑制，AdpA的表达又受到ArpA的抑制，A因子与ArpA的特异性结合能解除这种抑制，使得adpA基因得以表达，从而促进strR得以转录刺激链霉素的合成。AdpA是一个多效调节因子，不仅能促发链霉素的生物合成还能促发链霉菌的生理分化［12］。Shin等［23］以此为背景进一步研究了SAM对链霉菌次级代谢的调节机制，突变株S.griseus HO1(adpA的启动子不受ArpA的抑制)被用来判断SAM对链霉素的促进作用是否与ArpA对adpA的控制有关，结果发现加入SAM后，野生型菌株和突变株中链霉素的产量和adpA的转录量都有增加，这说明SAM是通过促进adpA的转录来刺激链霉素的合成，且这种促进作用与ArpA无关。进一步研究发现，SAM对S.lividans中strR的转录同样有促进作用，这暗示着有可能是在SAM的加入后AdpA的同系物BldHsl加速了strRp的转录，然而，结果表明额外加入SAM并没有使bldHsl的转录增加，这说明SAM对bldHsl基因表达的影响还可能涉及到一种转录后的控制。必须注意到AdpA和BldH蛋白非常的相似，但它们的启动子序列却明显不同，意味着adpA和bldH基因在转录水平上受到了明显不同的调节控制。对bldH基因表达的转录后控制，涉及到一个亮氨酸TTA密码子。Xu等［24］对S.libidans通过敲除bldHsl实验证明了bldHsl控制着strRp的转录，另外还发现当bldHsl上唯一的亮氨酸TTA密码子变成TTG时，SAM对strRp活性的诱导、对redZ和actIIORF4的转录以及对抗生素产量的影响都消失了，说明BldHsl参与到SAM对抗生素合成的调节中，SAM是通过TTA密码子控制bldHmRNA的翻译。Park等［22］向 S.coelicolor M145 培养基中加入 2 μmol/L的SAM，促进了放线菌紫素和十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin)的合成，但抑制了细胞生理的分化。S.coelicolor M145发酵过程中总蛋白的变化过程显示SAM促进了与ABC转运子相关的寡肽结合组分的表达，其中包含BldK，它是S.coelicolor分化过程中一个非常重要的调节因子。用放射性标记的SAM进行添加实验发现额外添加的SAM能进入细胞，而且这一过程受到bld链的控制，bld链是控制灰色链霉菌生理形态分化的重要调控元件，它受A因子信号系统的控制;这一研究证实了BldK是SAM信号的一个传递因子。这些发现也意味着SAM参与微生物次级代谢调控的过程与A因子信号系统有着紧密的联系。

此 外，Maharjan 等［25］将 来 自 S. peucetius ATCC27952的两个基因metK和afsR(A因子合成酶)分别表达到S.venezuelae ATCC15439使得苦霉素(pikromycin)产量增加了1.6倍和2.6倍。另外，同时表达2基因不仅促进了苦霉素的产量，还促进了途径专一性调节基因pikD的表达。Wang等［26］同时将adpA，metK，VHbS(另一种抗生素调节因子)3种基因整合到一个质粒上，将此质粒导入到 Streptomyces sp.FR-008，使得大环内酯类抗生素FR-008-Ⅲ(也称克念菌素D)的产量提高了3.1倍;单独表达某一种基因时产量分别只提高1.9、1.9和2.5倍;将该质粒导入到S.avermitilis中也促进了阿弗菌素的合成，该质粒也可能对链霉菌属中其它次生代谢产物的合成也有促进作用。这些同时表达A因子和SAM相关基因促进抗生素合成的研究也意味着SAM能和其它已知或未知的调节系统共同组建成非常复杂的微生物次级代谢调控网络。

4 总结和展望

SAM是生物体内重要的生理活性物质和中间代谢物质，具有广泛的生物学功能。随着基因工程和代谢工程技术的快速发展，越来越多的关于生物体内SAM的代谢循环途径及其关键酶逐渐被人们所认识，这将为提高SAM自身的生物合成提供更多的方法。近年来SAM对微生物生理分化和次生代谢产物合成的调控作用也逐渐成为研究的热点，通过外源少量添加SAM或过量表达SAM合成酶基因的方式来提高细胞内SAM的含量进而提高某些抗生素的产量已成为可能，且SAM在生物体内几乎无处不在，提高胞内SAM含量并不会给下游的产物提取带来麻烦。

然而，在目前所报道的文献中，SAM促进微生物次生代谢产物的合成主要集中在链霉菌属中，而对于其他菌属研究的甚少。浙江工业大学生物工程研究所近年来承担了国家新药创制重大科技专项和浙江省重大科技专项等项目研究，对于利用犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)生产糖尿病治疗药物阿卡波糖的发酵过程和代谢调控等方面也做了大量的工作［27］。研究中发现在培养基中添加低浓度(10～200 μmol/L)的SAM对于提高阿卡波糖的产量具有明显的促进作用(提高浓度超过30%)，通过对其调控机制分析表明，SAM提高阿卡波糖的作用主要可能是由于其作为信号分子促进了与ABC转运子相关的寡肽结合组分的表达，而在阿卡波糖合成中，ABC转运蛋白对前体物质麦芽糖或麦芽三糖合成阿卡波糖起着重要的作用。研究小组也将进一步考虑将SAM合成酶基因在A.utahensis过量表达，并深入探索SAM对阿卡波糖生产过程中的代谢调控机制。这些研究不但可以拓展SAM对微生物此生代谢的调控作用，同时，随着对其中SAM的调控机制以及SAM与其他小分子调节系统(如 γ-丁酸内酯、cAMP、ppGpp等)之间的相互关系的深入研究，也将为揭示复杂的微生物次级代谢调节系统提供更多的理论基础。

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