特基拉芽孢杆菌来源β-1，3-1，4-葡聚糖酶重组菌发酵培养基的优化*

刘晓玲，王金晶，李永仙，朱林江，李崎

1(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)2(江南大学生物工程学院酿酒科学与工程研究室，江苏无锡，214122)

大麦作为一种重要的工业原料，被广泛应用于啤酒酿造工业及饲料工业。但其胚乳细胞壁中含有的丰富的β-1，3-1，4-葡聚糖会对其应用造成一定的障碍，如麦芽中残留的β-葡聚糖不但会降低麦汁的过滤速率，而且会造成成品啤酒的非生物浑浊。再者，饲料中使用大量大麦，由于动物体内没有可降解β-葡聚糖的酶系，使动物消化道不能降解大麦细胞壁，降低饲料的利用率，同时可能导致家畜肠道疾病［1］。因此，在糖化过程中或饲料中添加适量的β-1，3-1，4-葡聚糖酶将有效缓解上述问题。目前市场上所使用的β-1，3-1，4-葡聚糖酶主要来源于真菌发酵生产，价格较昂贵。构建高效表达的基因工程菌株生产β-1，3-1，4-葡聚糖酶成为研究热点。山其木格等［2］将来源于地衣芽孢杆菌WS-6的β-1，3-1，4-葡聚糖酶在大肠杆菌BL21中成功表达，胞外酶活力为1 131.2 U/mL。李卫芬等［3］利用载体pET-30a在大肠杆菌中成功表达了浸麻芽孢杆菌的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，胞外酶活力为 60.4 U/mL。谢焱［4］、李永仙等［5］在大肠杆菌中表达了来源于淀粉液化芽孢杆菌BS5582的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，培养基优化后诱导表达酶活为1 570.83 U/mL。本实验室选育的1株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)，具有分泌 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的能力，经序列比对后发现该酶基因与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相似度为97.93%，与萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)相似度为94.24%，与淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BS5582相似度为92.98%，与 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)相似度分别为89.3% 和85.6%，序列上传GenBank后所获登录号JX412372。为进一步研究该葡聚糖酶的性质，将其基因在大肠杆菌中进行表达并获得成功。本次研究采用响应面法(RSM)优化培养基组分，以期得到更好的表达效果，为重组β-1，3-1，4-葡聚糖酶的规模化生产及应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基

重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)-pET-28a(+)-bgl为本实验室构建，用于表达来源于特基拉芽孢杆菌B.tequilensis CGX5－1的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因bgl，其中bgl含有该酶自身信号肽序列，表达产物可直接分泌至胞外。

本次研究所使用种子培养基为LB培养基(tryptone 10 g/L，yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0)，初始发酵培养基分别为TB培养基(yeast extract 24 g/L，tryptone 6 g/L，甘油 4 mL，蒸馏水 900 mL，KH2PO42.31 g/L，K2HPO42.54 g/L)、SB 培养基(yeast extract 30 g/L，tryptone 20 g/L，葡萄糖20 g/L)和M9培养基(参见分子克隆指南)。诱导剂为IPTG和乳糖［7－8］。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法

菌种活化:取甘油保藏管中融化的菌液划线至卡纳霉素(浓度50 μg/mL)抗性平板上，37℃培养至形成明显单菌落。

种子培养:挑取一单菌落接种至新鲜种子培养基(含终浓度50 μg/mL卡纳霉素)中，37 ℃，200 r/min培养12 h，以4%接种量转接至新鲜种子培养基(含终浓度50 μg/mL卡纳霉素)中，培养至OD600=1.2～1.5时，即为种子液。

摇瓶发酵:将种子液以8%接种量转移至发酵培养基(含终浓度50 μg/mL卡纳霉素)中，37℃，200 r/min培养至OD600=1.0，加入诱导剂乳糖(终浓度8 mmol/L)和IPTG(终浓度0.06 mmol/L)后，于24℃低温诱导发酵。

1.2.2 酶活测定方法

发酵液8 000 r/min离心3 min后取出上清液，用蒸馏水稀释合理倍数后，于40℃预热。用等体积预热至40℃的20 mmol/L pH 6.0的磷酸缓冲液稀释的蓝色大麦β-葡聚糖溶液(Megazyme公司)。取0.1 mL稀释酶液加入0.4 mL蓝色大麦β-葡聚糖底物中，于40℃反应10 min后向每个样品中加入3 mL沉淀液(由硫酸锌、乙二醇甲醚、盐酸、乙酸钠配制而成)后立即混匀，静置5 min后离心，测定上清液A590值，对照组为先加入沉淀液后加入蓝色大麦β-葡聚糖底物的稀释酶液。

β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活力的定义为:1 mL 发酵液于40℃、pH 6.0，每分钟分解大麦β-葡聚糖产生1 μmol还原糖定义为1个酶活单位(U)。

1.2.3 响应面法实验设计

本研究以β-葡聚糖酶活为因变量(Y)，TB培养基各组分为变量(X)，利用Minitab16软件进行25－1部分重复因子设计，每一独立变量在高(+1)和低(－1)两个水平上进行实验，设计结果如表1所示。

表1 部分因子设计编码值及水平

将部分因子实验结果与中心点实验结果进行t检验，根据t检验结果进行最速上升实验。

根据中心组合设计进行实验后，对结果进行二次回归拟合，得到平方项和交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，可在一定水平范围内求出最佳值。二次回归模型可表述为方程:

其中:Y为预测响应值，即发酵液β-葡聚糖酶的酶活;b0为截距，bi，bii，bij为回归方程的线性系数、二次项参数和交互参数;xi和xj是实验设计因子的编码值。

通过响应面分析可以对影响β-葡聚糖酶合成的因素及其交互作用进行评价，并能对培养基各组分的浓度分别进行优化，以获得影响过程的最佳配比。

2 结果与分析

2.1 重组大肠杆菌发酵培养基的选择

在相同的培养条件下，培养基营养成分不同会直接影响细胞增殖，从而影响到产物的表达效率。为了获得较高的生物量及表达效率，本研究使用TB、LB、SB及M9四种常见培养基进行重组菌的发酵培养，使用相同的诱导条件，结果如图1所示。

图1 重组大肠杆菌在不同培养基中的生长状况Fig.1 Grouth curve of recombinant E.coli in different fermentation mediums

根据图1中所得重组菌在个培养基中最大OD600值对照菌体干重与光密度校准曲线可知，在TB、LB、SB及M9培养基中最大生物量分别为6.79 g/L、1.72 g/L、2.59 g/L 及 1.28 g/L，胞外 β-葡聚糖酶活力最高值分别为1 671.9 U/mL、330.2 U/mL、375.3 U/mL及293.7 U/mL，由此可知TB培养基为最适发酵产酶培养基。

2.2 发酵培养基中碳源与氮源的选择

为了进一步提高目的蛋白的表达量，本研究以TB培养基作为初始发酵培养基，对其成分进行优化。首先研究不同碳源物质如甘油、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉、小麦粉、大麦粉及玉米粉等对β-葡聚糖酶产量的影响。各物质添加量均为5 g/L，由图2可知，相同添加量下，以甘油为碳源时β-葡聚糖酶活力最高，可能是甘油作为小分子物质更易被细胞摄取并直接利用。而葡萄糖为碳源时酶活力最低，由于葡萄糖的分解代谢产物会对质粒中的lac操纵子造成阻遏效应，进而影响目的基因的表达。其他碳源物质如玉米粉、大麦粉等虽然产量也较高，但需额外添加高温淀粉酶以消化原料，故不予采用。

图2 不同碳源对β-葡聚糖酶表达量的影响Fig.2 Effects of different carbon source on the production of β-1，3-1，4-glucanse

图3 不同氮源对β-葡聚糖酶表达量的影响Fig.3 Effects of different nitrogen source on the production of β-1，3-1，4-glucanse

保持TB培养基其他成分不发生变化，分别添加相同氮原子摩尔数的5种有机氮源和4种无机氮源。结果如图3所示，使用无机氮源时β-葡聚糖酶活力仅为有机氮源最高酶活力的10%左右，可能无机氮源仅能维持细胞生长，而不能为大量合成的目的蛋白提供原料。Tryptone为进口培养基，而胰蛋白胨为国产培养基，虽同为胰蛋白胨，然二者对 β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力影响明显不同，分析后发现，二者的氨基酸种类并无差别，仅个别氨基酸含量差异较大，可能国产胰蛋白胨的纯度较低，其微量杂质反而更有利于重组菌的生长。有机氮源中效果最显著的为Yeast extract和胰蛋白胨，Yeast extract除了含有大量氨基酸外还有核酸、维生素类等微生物生长所必须的营养因子，相对而言，胰蛋白胨组成成分较为单一，考虑到二者在营养成分上可互补，故选择两者作为复合氮源。复合氮源配比实验结果表明，当二者共同为复合氮源时β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力比单一氮源时高(数据未显示)。李永仙［9］、房淑颖［10］在对重组大肠杆菌的培养基进行优化时，均使用复合氮源而非单一氮源，不但能够提高目的蛋白产量而且会降低培养基成本。

2.3 部分因子设计及结果

表2 部分因子实验设计与结果Table 2 Experimental design and results of FFD

对部分因子实验结果进行回归分析可知，考察的因素中 Yeast extract和 KH2PO4对 β －1，3－1，4－ 葡聚糖酶合成具有负效应，故对这2个因素取低水平值。胰蛋白胨、甘油和 K2HPO4对 β －1，3－1，4－葡聚糖酶合成具有正效应，故对其取高水平值。实验结果的方差分析如表3所示，其中P值小于0.05的因素可认为其对发酵结果的影响显著。可知胰蛋白胨(0.001)和甘油(0.000)是显著影响因子。

表3 部分因子实验回归分析结果Table 3 Regression results of FFD

由回归分析结果可得一次拟合线性回归方程:

实验模型的回归方程决定系数R2=92.9%，调整决定系数=90.4%，说明模型可以很好地解释实验结果。

2.4 最速上升实验

从回归方程中胰蛋白胨和甘油的系数(X2:55.5，X3:364)可以得这两个因素步移的步长之比为(1∶6.56)，即当胰蛋白胨步移1个单位(1 g/L)时，甘油步移6.56 mL/L。以部分因子实验设计的中心点作为步移的起点，实验设计与实验结果如表4所示。从实验结果可以看出，步移启动时β-葡聚糖酶酶活随着胰蛋白胨与甘油浓度的升高而增加，在步移进行至第二步时达到最高点(2 915.2 U/mL)，之后β-葡聚糖酶活开始下降。步移最高点时胰蛋白胨与甘油的浓度分别为13 g/L和10.56 mL/L，这一点被用作响应面分析中心点

表4 最速上升实验结果Table 4 Experimental results of steepest ascent path

2.5 中心组合设计及结果

以上研究利用部分因子设计确定了胰蛋白胨和甘油两个显著影响因素后，利用最速上升实验确定了最优的取值范围。此部分研究利用基于中心组合设计的响应面分析法对这两个因素进行进一步的优化。

中心组合实验设计及结果如表5所示，共有13个实验点。13个实验点可分为两类:一类是析因点，即自变量取值在X2、X3所构成的三维顶点，共有8个析因点;另一类是零点，为区域的中心点，零点实验重复5次，用以估计实验误差。

表5 中心组合设计及结果Table 5 Design and results of central composite design

以胰蛋白胨和甘油为自变量，β－葡聚糖酶活为响应值，利用Minitab 16.0分析实验数据，分析结果如表6所示，所得数学模型为:

表6 中心组合实验回归分析结果Table 6 Regression results of CCD

其中Y为响应值(β-葡聚糖酶酶活)，X2为胰蛋白胨浓度，X3为甘油浓度。回归方程各项的方差分析表明，方程一次项与二次项的p值均小于0.05，说明胰蛋白胨与甘油的单独影响与交互影响都较为显著。实验模型的回归方程决定系数R2=96.65%，调整决定系数R2

Adj=94.26%，说明模型可以很好地解释实验结果。

2.6 响应面分析

对中心组合设计确定的各参数取值范围进行响应面分析，所得结果如图4所示。

由图4可知在实验取值范围内2图都有最大值(响应面的顶点或等高线的最高点)，即两因子间的相互作用存在有利于β-葡聚糖酶酶活的最优组合。利用Minitab 16.0软件预测功能对两个因素的最佳值进行寻优，到当X2=12.5 g/L与X3=14.1 mL/L时，响应值β-葡聚糖酶酶活有最大值，预测值为2 935 U/mL。

图4 胰蛋白胨和甘油与β-葡聚糖酶酶活的响应曲面及等值线Fig.4 The response surface plot and isolines for the effect of Tryptone and Glycerin on glucanase production

综上研究结果可知，重组大肠杆菌发酵产β-葡聚糖酶的最适培养基成分为:Yeast extract 20 g/L，胰蛋白胨12.5 g/L，甘油14.1 mL/L，KH2PO42.17 g/L，K2HPO42.74 g/L。

2.7 响应面优化结果验证

验证实验结果表明，初始培养基经过优化后，β-葡聚糖酶酶活(2 978.2 U/mL)与初始培养基(1 671.9 U/mL)相比，提高了1.78倍，与2 935 U/mL的预测值较为接近，相对误差为0.14%，同时证明了回归方程的可靠性和统计学方法的有效性。

3 结论

重组大肠杆菌产β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最适培养基为TB培养基，与其它培养基相比，在TB培养基中生长状况最好且酶活力最高。甘油为培养基的最佳碳源，其不仅为大肠杆菌的生长提供能量，而且能够维持生长过程中细胞的形态，故而以此为碳源时发酵液上清中β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力最高。Yeast extract和胰蛋白胨为培养基的最适氮源，二者为大肠杆菌的生长提供丰富的氨基酸、核酸等氮源，而且酵母粉中含有维生素等微生物必不可少的生长因子，这与程至敬等［11］的研究结果相符。为了提高β-1，3-1，4-葡聚糖酶的产量，研究采用响应面法优化TB培养基组分。结果表明，胰蛋白胨和甘油为显著影响β-1，3-1，4-葡聚糖酶产量的因素，通过最速上升实验及中心组合设计，结合响应面分析，最终得出TB培养基组分为:酵母粉20 g/L，胰蛋白胨12.5 g/L，甘油14.1 mL/L，KH2PO42.17 g/L，K2HPO42.74 g/L。使用优化后培养基发酵，上清中β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力较优化前提高了1.78倍，说明响应面优化效果较为理想。本次研究通过对发酵培养基的优化，使得重组菌发酵产β-1，3-1，4-葡聚糖酶的产量有所上升，对日后重组酶特性的研究及其规模化生产应用等工作的展开具有积极的意义。

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