立体选择性脂肪酶的筛选及其在薄荷醇拆分中的应用

徐 刚，李 牧，孙苗苗，吴坚平，杨立荣

(浙江大学 化学工程与生物工程学系，杭州 310027)

L－薄荷醇是全球销量最高的香料之一，被广泛应用于食品、医药、卫生以及化妆品行业。然而，天然的L－薄荷醇产量与品质受天气与种植地域的影响较大，无法满足市场需求。化学合成的薄荷醇以4对薄荷醇(DL－新薄荷醇、DL－异薄荷醇、DL－薄荷醇与DL－新异薄荷醇)混合物的形式存在。其中，L－薄荷醇具有最高的清凉与阵痛功效，其他几种薄荷醇如D－薄荷醇的口感与气味较差，严重影响了化学合成产品的质量［1］。因此，有必要针对化学合成产物进行拆分以制备高纯度的L－薄荷醇。

化学催化是制备L－薄荷醇的主要方法［2］。但是，化学催化过程存在环境污染与高能耗的问题。与此同时，生物催化剂以其低能耗、低成本、原子经济性和更短的合成路线受到越来越多的关注。脂肪酶作为一类重要生物催化剂，具有较高的稳定性、不需要辅助因子、底物谱广泛与较高的立体选择性等特点，成为工业用酶的研究热点之一。目前已有一些关于脂肪酶用于薄荷醇拆分过程的报道［3－4］，但底物主要局限于 DL － 薄荷醇，与实际应用存在一定差距。因此，筛选能够直接以4对薄荷醇为底物进行高效拆分的高立体选择性微生物脂肪酶，成为工业应用的关键步骤。

笔者主要利用双平板透明圈法，从93个产脂肪酶微生物中筛选得到1株高选择性脂肪酶产生菌——产碱假单胞菌(Pseudomonas)，其所产脂肪酶对L－薄荷醇丙酸酯表现出较高的立体选择性与催化活力。本文对脂肪酶催化拆分4对薄荷醇的最适条件以及底物特异性进行研究，以期为其生产应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 土样采集

土样采自杭州萧山化工厂附近受油污污染的土壤，取地表下10～20 cm深的湿润土样，4℃封存待用。

1.1.2 主要试剂

对硝基苯酚脂乙酸酯、硝基苯酚脂丁酸酯、硝基苯酚脂辛酸酯、硝基苯酚脂月桂酸酯、硝基苯酚脂油酸酯、三丁酸甘油酯、L－薄荷醇与DL－薄荷醇购自美国Sigma公司;乙腈、二甲基亚砜(DMSO)等均为国产试剂级纯度;DNA聚合酶购自美国Fermentas公司。

1.1.3 筛选培养基

筛选培养基(g/L):葡萄糖5，蛋白胨10，酵母膏3，K2HPO41。用NaOH调至pH为7.2。三丁酸甘油酯、L－薄荷醇丙酸酯与4对薄荷醇丙酸酯用聚乙二醇(PEG)乳化后过滤除菌(0.22 μm)，分别以2%质量分数加入上述培养基待用。

发酵培养基(g/L):橄榄油10，Tween－80 5，蛋白胨10，酵母膏 5，K2HPO41，无水 MgSO40.2。用NaOH调至pH为7.2。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种初筛

将采集的土样0.1 g用无菌水100 mL溶解，以5%接种量接种到含有50 mL液体发酵培养基的250 mL三角瓶中，30℃摇床转速200 r/min，培养24 h。取液体培养物用无菌水稀释至10－6、10－7和10－8倍，均匀涂布在三丁酸甘油酯筛选平板上，30℃下培养24～48 h，将具有水解圈的单菌落分别挑至含有L－薄荷醇丙酸酯和4对薄荷醇丙酸酯的筛选平板。在30℃恒温培养箱中培养24～48 h。观察水解圈大小，将初筛单菌落接种5 mL试管培养并保存菌种待用。

1.2.2 菌种复筛

将初筛菌种接种到50 mL液体发酵培养基中，30℃摇床转速200 r/min培养24 h。12 000 r/min离心5 min除去菌体，取上清液(保存于4℃)作为待测粗酶。加入50 mmol/L终浓度的4对薄荷醇丙酸酯底物，37℃下反应5 min，用等体积的正己烷与之剧烈混合，移取正己烷并用无水Na2SO4脱水，进行气相色谱分析。对映体过量值(e.e.p)与非对映体过量值(d.e.p)按文献［5］计算，绝对转化率 =L－薄荷醇质量浓度/初始L－薄荷醇丙酸酯质量浓度×100%。

1.2.3 菌种鉴定

反复划线分离单菌落之后，培养并收集新鲜微生物菌体，用16sDNA通用引物克隆该细菌的16sDNA片段，通过碱基测序并在NCBI上比对，构建系统发育进化树，鉴定微生物的种属关系。

1.2.4 脂肪酶活力测定

脂肪酶水解对硝基苯酯的过程，在405 nm吸收波长下被分光光度计测量。底物对硝基苯酚辛酸酯溶解于乙腈中，储存浓度20 mmol/L。在酶活测定中，取20 μL底物储存液，加入到0.96 mL的50 mmol/L磷酸盐缓冲液PBS(pH=8.0)中，35℃预热10 min，然后加入20 μL同样预热的粗酶液开始反应。反应条件为35℃下5 min。酶活单位定义为每分钟水解生成1 μmol对硝基苯酚所需的酶量［5］。

1.2.5 温度对脂肪酶活性影响测定

在20～60℃ (间隔10℃)下，测定酶活力，以确定最适反应温度。将初始酶液分别置于20、30、40、50和60℃中分别保温30 min，测定剩余酶活，以开始时的酶活力为100%，计算相对活力，以确定酶的热稳定性。

1.2.6 pH对脂肪酶活性影响测定

测定酶在不同pH缓冲液(pH 6.0～11.0)中的酶活力(其中 pH为6.0～7.0用50 mmol/L的醋酸－醋酸钠缓冲溶液，pH为7.0～9.0用50 mmol/L的磷酸钠缓冲液，pH为9.0～11.0用50 mmol/L的Gly－NaOH缓冲液)，以确定酶的最适反应pH。

将酶置于不同pH(5.0～11.0，间隔1.0单位)缓冲液，4℃放置24 h后，于35℃、50 mmol/L、pH 9.0的Gly-NaOH缓冲液中反应测定酶活，以酶活力最高点的相对酶活力为100%，确定pH稳定性。

1.2.7 脂肪酶对对硝基苯酚酯类的底物偏好性

选择不同长度的脂肪酸(C2～C16)对硝基苯酯为底物，测定最适底物。酶活测定方法同1.2.4部分。

1.2.8 对薄荷醇丙酸酯拆分研究

薄荷醇酯拆分结果在气象色谱仪上分析测试。将4对薄荷醇丙酸酯溶于DMSO待用。向粗酶液2 mL中加入终浓度为50 mmol/L 4对薄荷醇丙酸酯底物，于35℃反应，气相检测拆分效果。

2 结果与讨论

2.1 双平板透明圈法初筛

被脂肪酶菌株水解后，L－薄荷醇丙酸酯筛选平板与4对薄荷醇丙酸酯筛选平板中产生了透明圈，但由于立体选择性的差异，选择性较好的微生物在2块平板上水解底物的速度不一样，因此，L－薄荷醇丙酸酯平板与4对薄荷酯平板上的透明圈浊度差别越大，选择性越强。据此方法，从土样中初筛出11株具有明显选择性的菌株，待进一步复筛。

2.2 菌种复筛及种属关系的鉴定

经培养后，测定含有脂肪酶的上清液酶活达到174.2 U/L(以硝基苯酚辛酸酯为底物);当粗酶液水解拆分DL－薄荷醇丙酸酯的反应转化率达到50%以上时，测定其选择性。其中，选择性最好的一株微生物所产的胞外水解酶，在绝对转化率较高(＞30%)时，e.e.p＞99%。将该微生物的16S rDNA 测序并在NCBI上BLAST比对，发现与产碱假单胞菌的同源性大于98%，通过构建系统发育进化树(图1)，确定该微生物是产碱假单胞菌Pseudomonas alcaligenes。

图1 产碱假单胞菌进化树Fig.1 Phylogenetic tree of Pseudomonas alcaligenes and closely related strains

2.3 温度对脂肪酶活力的影响

反应温度是酶催化的重要影响因素之一。在pH 9.0 Gly－NaOH缓冲液体系中，测定温度对酶活的影响(图2)。由图2可知:酶在30～35℃时具有较高的活性，在35℃活性达到最高。与Psuedomonas sp.KB700A［6］、Psuedomonas sp.S5［7］和P.fluorescens MC50［8］所报道的脂肪最适反应温度一致，在35℃左右。

图2 温度对脂肪酶活性的影响Fig.2 Effects of temperatures on Pseudomonas alcaligenes lipase

酶的热稳定性受很多因素影响，如氨基酸组成、二硫键、疏水作用、离子对、多聚体和α－螺旋的双电极稳定化作用等。图2表明该酶在30℃以下具备较好的稳定性，超过40℃快速失活。40℃条件下，放置30 min，残余酶活只有18%。当温度大于60℃时，脂肪酶基本失活。因此综合酶的反应活性与热稳定性，选择35℃为最适温度。

2.4 pH对脂肪酶活力的影响

在最适温度下，考察最适反应pH，结果见图3。图3表明最适反应pH为9.0，且发现该酶在pH 8.0～11.0时均具有较佳的酶活力，活力最高维持在pH 9.0附近。将置于不同的pH缓冲条件下的酶在4℃放置24 h，测定残余酶活，结果显示该酶在pH 6.0～11.0时具有较佳的稳定性。脂肪酶在范围较广的pH范围内都保持较佳的稳定性。与报道的Pseudoalcaligenes F －111［9］脂肪酶pH 稳定性(pH 6.0 ～10.0)相似。

2.5 脂肪酶对对硝基苯酚酯类的底物特异性

图3 pH对脂肪酶活力的影响Fig.3 Effects of pH on Pseudomonas alcaligenes lipase

以不同碳链长度的对硝基苯酯为底物，考察了产碱假单胞菌脂肪酶的底物特异性，结果见图4。由图4可知:该酶对不同长度的对硝基苯酯底物的均能表现出活性，在催化pNPC8水解时表现出最大的活力。酶对 pNPC2、pNPC4、pNPC12和2pNPC16都表现出一定程度的水解活性。

图4 脂肪酶底物特异性Fig.4 Substrate specifity of Pseudomonas alcaligenes lipase

由图4还可知:脂肪酶对中等链长的对硝基苯酚辛酸酯pNPC8的水解能力最强且底物范围较窄。对 C2、C4底物的酶活仅为 2%、4%，对 C12、C16的底物酶活仅为42%、11%。因此，该脂肪酶虽然催化长链脂肪酸甘油酯的水解能力较弱，但相比短链底物具有长链偏好性，所以应该属于脂肪酶。

2.6 脂肪酶对4对薄荷醇丙酸酯的拆分

脂肪酶能选择性水解4对薄荷醇丙酸酯混合物中L－薄荷丙酸酯为L－薄荷醇。水解反应在水相中进行，反应结束后用正己烷萃取，萃取率大于95%。气相分析表明:该酶具备较高的产物e.e.p值，随着有效转化率的上升，重组酶一直保持很高的产物e.e.p值，但d.e.p不断下降。当绝对转化率达到50%时，对映体过量值大于99%，D－薄荷醇丙酸酯几乎不被水解，非对映体过量值大于90%，主要原因是L－新异薄荷醇被少量水解，导致产物纯度下降。

3 结论

采用双平板透明圈法初筛，气相色谱复筛的筛选模型，从土样中筛选得到一株高立体选择性脂肪酶菌株产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)。通过油脂诱导培养基发酵，对获得的粗酶进行了酶学性质测定。发现产碱假单胞菌脂肪酶最适温度为35℃，30℃以下相对稳定;最适pH在9.0，稳定范围比较宽，为pH 6.0～11.0。拆分4对薄荷醇丙酸酯具有较高的选择性，绝对转化率50%时，发现e.e.p大于 99%，d.e.p大于 90%。因此产碱假单胞菌脂肪酶具有广阔工业应用前景。

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