口服积雪苷和槲皮素对兔耳增生性瘢痕的影响

黄久佐　王晓军

[摘要]目的：探讨口服积雪苷和槲皮素对兔耳增生性瘢痕的影响。方法：新西兰大白兔9只，在兔耳腹侧制备标准创面（每耳4个，共72个），随机分为3组：空白对照组、积雪苷组及槲皮素组。4周后收集标本，从瘢痕横截面最高点制作切片，比较各组的瘢痕增生指数。结果：积雪苷组（1.55±0.03）与空白对照组（1.67±0.02）相比，瘢痕增生指数明显降低（17.9%），有统计学显著性差异（P=0.003）。槲皮素组（1.59±0.03）与空白对照组相比，两者瘢痕增生指数无统计学显著性差异（P=0.053）。结论：口服积雪苷可显著抑制兔耳瘢痕增生，口服槲皮素对兔耳增生性瘢痕的抑制作用尚待进一步实验证实。

[关键词]增生性瘢痕；积雪苷；槲皮素

[中图分类号]R619+.6 Q136 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）05-539-03

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，其形成机制不明，治疗效果欠佳，是整形外科面临的难题之一。积雪苷是从伞形科植物积雪草提取的有效成分，已有外用积雪草苷对兔耳增生性瘢痕模型疗效的研究，且临床已用于治疗多种疾病，如黄褐斑、局限性硬皮病及瘢痕疙瘩等。槲皮素是广泛存在于自然界的天然物质，前期体外实验结果提示其可能通过多条信号通路抑制病理性瘢痕。本实验建立增生性瘢痕动物模型，实验动物口服积雪苷和槲皮素，通过计算和比较瘢痕增生指数探索对增生性瘢痕的影响，从而为临床上防治增生性瘢痕寻找新的方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器：9只新西兰大白兔，体重2.5～3.0kg，雌雄不限，由北京协和医院动物房提供。槲皮素（美国Sigma公司）；积雪苷（上海秀龙中药有限公司）；光学显微镜（德国Leica DM3000以及德国Leica S8AP0）、显微镜摄像头（德国Leica DFC 420C）。

1.2 兔耳瘢痕模型的制作：氯胺酮（2mg/kg）和地西泮（5mg/kg）肌肉注射麻醉，选取兔耳腹侧的少毛区，在无菌条件下用皮肤活检器及手术刀切除表皮、真皮及软骨膜，保留软骨。每耳制备4个直径7mm的标准创面。压迫止血，用Tegaderm透明敷料（3M公司）覆盖创面。所有创面都在术后14天之前完成再上皮化，术后14天移除透明敷料。9个创面出现软骨干燥和瘢痕内陷（对照组2个，积雪苷组4个，槲皮素组3个）。术后29天共回收63个增生性瘢痕标本（对照组22个，积雪苷组20个，槲皮素组21个）。

1.3分组给药：积雪苷组，每天用含36mg积雪苷的药液进行1次灌胃处理；槲皮素组，每天用含100mg槲皮素的药液进行1次灌胃处理。给药处理从手术当天开始，每天给药1次，直至术后第28天。对照组不给药。

1.4 标本收集和处理：术后第29天，切取标本，包括瘢痕及其周围直径5mm的正常皮肤。从瘢痕最高处制作切片，4%甲醛缓冲液固定48h，80%～100%酒精梯度脱水，二甲苯两次透明，浸蜡3h（更换3次石蜡），石蜡包埋（65℃），制作厚度4μm的组织切片。切片经干燥、脱蜡后苏木素染色5min，0.5%盐酸酒精溶液分化5s，稀氨水冲洗30s，0.5%伊红复染2min，再经常规脱水、透明、封片、镜检。

1.5组织学检查：用德国Leica S8AP0光学显微镜上的Leica DFC 420C相机拍摄用于定量计算瘢痕增生指数的数码照片，用德国Leica DM3000光学显微镜上的Leica DFC 420C相机拍摄用作组织学定性分析的数码照片。用Leica Qwin Plus图像处理软件，对每个瘢痕的横截面进行测量（如图1所示），取两次测量所得数据的平均值。基线面积定义为在显微镜下观察到的与周围正常皮肤持平的软骨之上的瘢痕面积（即图中 部分面积）。基线面积的厚度为其周围正常无瘢痕皮肤的厚度，长度则以隆起的增生性瘢痕与周围无瘢痕的正常皮肤为界。而增生面积则定义为在基线面积之上（不含表皮面积）的瘢痕面积（即图中 部分面积）。瘢痕增生指数是创面的总面积（即基线面积与增生面积之和）除以增生性瘢痕之下的组织面积（即基线面积）得到的比值。若瘢痕增生指数为1，则表示瘢痕的高度与周围正常未受创伤的皮肤相同，即瘢痕未发生增生；若增生指数>1，则表示出现了隆起的增生性瘢痕。

1.6统计学分析：用SPSS 17.0软件对各组数据进行独立样本t检验。P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 大体情况：空白对照组瘢痕块颜色较红、质地较硬、瘢痕高出皮肤平面，增生范围未超出原创缘；积雪苷组和槲皮素组瘢痕颜色偏淡，质较软，瘢痕较平。

2.2 病理结果：在低倍镜下（×10）可见（图2.1），对照组瘢痕明显高于周围皮肤；积雪苷组瘢痕与周围皮肤高度相似，未见明显隆起；槲皮素组瘢痕有一部分高于周围皮肤。在较高倍数下（×50）可见（图2.2），对照组瘢痕可见成纤维细胞在真皮浅层排列混乱，呈旋涡状/结节状，在真皮深层排列与皮肤平行。积雪苷组瘢痕真皮的成纤维细胞数量明显少于对照组瘢痕，而且排列较规则。槲皮素组瘢痕的成纤维细胞在真皮浅层排列混乱，呈旋涡状/结节状，在真皮深层排列与皮肤平行。

2.3瘢痕增生指数：对照组的瘢痕增生指数为1.67±0.02（n=22），积雪苷组的瘢痕增生指数则为1.55±0.03（n=20），结果有统计学显著性差异（P=0.003），积雪苷组的瘢痕增生程度比对照组减少17.9%；槲皮素组的瘢痕增生指数为1.59±0.03（n=21），与对照组相比无统计学显著性差异（P=0.053），槲皮素组的瘢痕增生程度比对照组减少11.9%。槲皮素组的瘢痕增生指数与积雪苷组相比则无显著性差异（P=0.271）。

3 讨论

1997年，Morris[1]等建立了兔耳增生性瘢痕模型。国内李荟元[2]等从1998 年起也建立了该模型。之后李希军[3]等也成功复制本模型。已有研究表明，兔耳增生性瘢痕从组织学至分子生物学水平均与人类增生性瘢痕相似[4]。本研究中共制作72处创面，形成增生性瘢痕63个，成功率为87.5%，与既往研究结果类似。

积雪草苷已在临床上用于治疗多种皮肤疾病，如皮肤溃疡、局限性硬皮病以及瘢痕疙瘩等，且已经证实外用积雪草苷对兔耳增生性瘢痕的疗效[5]。临床上有外用的积雪苷霜剂、积雪苷注射液及口服的积雪苷片剂等多种剂型，本实验发现口服积雪苷可以将兔耳瘢痕的增生程度减少19.7%，与对照组相比结果有统计学极显著性差异（P<0.001）。积雪苷抑制兔耳增生性瘢痕的机制可能是通过促进Smad7[6]表达和减少TGF-β1 mRNA的表达[7]。但由于中药本身成分复杂，其具体作用机理往往是多靶点、多环节的，需要更深层次的研究为其临床治疗提供有力的依据。

槲皮素广泛存在于洋葱、葡萄、苹果、茶等植物中，是人类及动物可以从食物中摄取的天然物质。体外实验的研究结果提示，槲皮素可以通过多条信号通路发挥抑制病理性瘢痕的作用[8]。但是目前外用槲皮素对病理性瘢痕抑制作用的动物实验[9]和临床试验[10]结果均为阴性。本研究采用兔耳增生性瘢痕的动物模型探索口服槲皮素的疗效，结果发现经槲皮素处理之后，瘢痕增生程度比对照组减少11.9%，但统计学上无显著性差异（P=0.0053）。我们之前的研究发现，槲皮素可增强放射线对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的抑制效应[8]，因此今后可进一步开展实验探索槲皮素作为放疗增敏剂对抑制瘢痕增生的作用。

[参考文献]

[1]Morris DE， Wu L， Zhao LL， et al. Acute and chronic animal models for excessive dermal scarring： quantitative studies[J]. Plast Reconstr Surg， 1997， 100（3）： 674-681.

[2]李荟元，刘建波，兰海. 建立增生性瘢痕动物模型[J]. 第四军医大学学报， 1998， 19（6）： 655-657.

[3]李希军，柳大烈，王吉慧. 兔耳增生性瘢痕模型建立方法的探讨[J]. 中国美容医学， 2006， 5（15）： 499-500.

[4]Kryger ZB， Sisco M， Roy NK， et al. Temporal expression of the transforming growth factor-Beta pathway in the rabbit ear model of wound healing and scarring[J]. J Am Coll Surg， 2007， 205（1）： 78-88.

[5]Xie JL， Qi SH， Li TZ， et al. Effect of asiaticoside on hypertrophic scar in the rabbit ear model[J]. J Cutan Pathol， 2009， 36（2）： 234-239.

[6]Qi SH， Xie JL， Pan S， et al. Effects of asiaticoside on the expression of Smad protein by normal skin fibroblasts and hypertrophic scar fibroblasts[J]. Clin Exp Dermatol， 2008， 33（2）： 171-175.

[7]赵文鲁，匡瑞霞，刘肃，等. 积雪草甙对兔耳增生性瘢痕TGF- β1 mRNA表达的影响[J]. 中国美容医学， 2009， 18（1）： 72-75.

[8]Long X， Zhang FQ， Wang XJ， et al. Influence of quercetin and x-ray on collagen synthesis of cultured human keloid-derived fibroblasts[J]. Chin Med Sci J， 2006， 21（3）： 179-183.

[9]Saulis AS， Mogford JH， Mustoe TA. Effect of Mederma on hypertrophic scarring in the rabbit ear model[J]. Plast Reconstr Surg， 2002， 110（1）： 177-183.

[10] Chung VQ， Kelley L， Marra D， Jiang SB. Onion extract gel versus petrolatum emollient on new surgical scars： prospective double-blinded study[J]. Dermatol Surg， 2006， 32（2）： 193-197.

[收稿日期]2012-10-21 [修回日期]2012-12-22

编辑/张惠娟