十大技术之一（二）甜瓜资源与品种核酸指纹鉴定关键技术

高鹏 王学征 栾非时

在全基因组水平利用分子标记技术，构建甜瓜种质核酸指纹库，建立早期、快速、准确的甜瓜种子纯度、真实性及资源的遗传血缘检测技术。

1 关键技术核心

筛选出用于构建甜瓜核酸指纹库的核心引物是关键技术问题。利用20份具有代表性的甜瓜品种（系）筛选1219对SSR引物，得到多态性的引物470对。综合考虑扩增条带统计难易、多态性信息含量（PIC）、整合遗传连锁图谱（ICUGI，2011，http：//www.icugi.org/.）等多种因素，最终选择其中18对扩增多态性丰富的引物作为核心引物。经过18对引物扩增后，可以对供试甜瓜品种（系）中的每一份材料建立了一个能区别于其他供试材料的指纹图谱代码。

2 技术流程

2.1 核心引物合成

按照表1合成18对核酸指纹库核心引物。

2.2 待测样品DNA提取

供试材料每份取10粒种子播种于8 cm×8 cm营养钵中，25 ℃、16 h/8 h光周期条件下生长，待同一品种植株生长到2叶1心时将每株幼嫩叶片摘下混匀，放入液氮中速冻，然后置于-80 ℃ 冰箱中保存。

DNA提取流程如下：

测定DNA原液浓度（分光光度计法），D260/OD280不足1.8或超过2.0的重新纯化，将纯化后的DNA稀释到30 ng·μL备用。

2.3 PCR扩增

以样品DNA作为模板，分别用18对核心引物对样品DNA进行PCR反应。反应体系见表2，反应条件见表3。

表2 PCR反应体系

2.4 电泳

取PCR扩增样品加入上样缓冲液（98%甲酰胺，10 mM EDTA，0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青）6 μL混合，95 ℃ 变性5 min，4℃ 低温保存。用6% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳，每个样品取5 μl，恒功率70W电泳约90 min，终止电泳。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳各操作步骤如下：

（1）清洗玻璃板：洗涤剂清洗制胶玻璃板，然后用蒸馏水冲洗干净并晾干。（2）擦板：将晾干的制胶玻璃板平放，先用蒸馏水擦拭玻璃板1次，然后用无水乙醇擦拭玻璃板1次，再用氯仿：剥离硅烷（49/1，V/V）擦拭短板，用亲和硅烷（6 mL无水乙醇，12 μL冰醋酸，12 μL亲和硅烷）擦拭长板。（3）灌胶：将长板与短板用夹子夹好，放平，取6% 聚丙烯酰胺胶60 mL，加入600 μL 10% 過硫酸铵和80 μL TEMED轻轻混匀，将板的灌胶边微抬起，把胶缓缓灌入，待胶全部灌入板之间时，将梳子插入合适的位置，最后将制胶板调至水平，凝胶2 h后可用于电泳。（4）预电泳：小心拔出梳子，将玻璃板两面冲洗干净，擦干，放入电泳槽装好，在电泳槽加入1×TBE，在80 W恒功率下预电泳20～30 min。（5）正式电泳：将点样孔中杂质用洗耳球吹出，然后加入5 μL已变性的扩增产物，70 W恒功率下电泳90 min。

2.5 银染

（1）固定：电泳停止后将长板立即放入10%固定液（2 L蒸馏水，200 mL冰醋酸），在摇床上固定30 min。（2）漂洗：将固定好的长板用蒸馏水漂洗3次，每次2 min。（3）染色：将长板放入染色液（2 L蒸馏水，2.3 g AgNO3）中，染色10 min。（4）漂洗：在蒸馏水中漂洗2～3次（不超过10 s）。（5）显影：将漂洗好的长板放入倒有预冷过的显影液（2 L蒸馏水，32 g NaOH，用前3 min加入16 mL甲醛）中，定影10 min。（6）漂洗：将长板在蒸馏水中漂洗2～3次（不超过10 s）。（7）晾板：将漂洗后的长板捞出放好，室温下自然风干。（8）记录：将晾干后的长板照相保存，统计结果。

2.6 指纹代码记录

每对SSR引物可以扩增出不同的多态性条带，依据扩增条带分子量从大到小的顺序记录各个条带的分子量（单位为bp，在这里略去单位bp，只记录数字），再将引物按照固定的顺序进行编号，依次为A、B、C……，记录每份材料经不同的SSR引物扩增出现的条带，如果一份材料经同一引物扩增同时出现多条条带，则用“-”连接数字，这样每个品种的DNA经不同的引物扩增后将会形成由字母和阿拉伯数字组成的一系列带型编号，进一步形成了该品种的SSR指纹图谱代码。例如：如某品种的SSR指纹图谱代码为A100B300-200C0…Q300R250，则表示该品种经A引物扩增出现了长度为“100 bp”条带，经B引物扩增出现了长度为“300 bp”和“200 bp”2条条带，经C引物没有扩增出条带……经Q引物扩增出现了长度为“300 bp”的条带，经R引物扩增出现了长度为“250 bp”的条带。

2.7 利用指纹代码检测种子

同物异名种子的判定：若获得的指纹代码与已知品种的指纹代码完全一致则可初步判断同物异名。同名异物种子的判定：若某品种的指纹代码与其固有代码不符则可判定同物异名。种子纯度的检测：选择品种两亲本存在差异的一对SSR引物对杂交种进行PCR检测，则F1种子均应为杂合带型，若其中出现单一带型则说明种子不纯。