蜂毒素诱导人Bel—7402细胞株恶性表型转化的实验研究

翟东霞　张亚妮　凌昌全

【摘要】 目的 观察蜂毒素处理人Bel-7402细胞株后对其恶性表达行为的影响。方法 浓度为2μg/ml和4μg/ml两个实验组，以全反式维甲酸作为阳性对照，从细胞增殖的抑制、ConA凝集及克隆形成能力、甲胎蛋白含量、c-myc基因表达等方面进行观察。结果 2μg/ml和4μg/ml蜂毒素均能抑制Bel-7402细胞株的增殖；蜂毒素处理后的细胞凝集及克隆集落形成能力降低；甲胎蛋白含量下降； c-myc基因表达显著降低。结论 低剂量蜂毒素能有效诱导人Bel-7402细胞株恶性细胞生物学行为的转化。

【关键词】 蜂毒素；人Bel-7402细胞株；恶性表型；逆转；诱导

【中图分类号】R2-031 【文献标识码】A 【文章编号】1004-4949（2013）06-39-03

恶性肿瘤是危害人类健康的严重疾病之一，普遍观点认为，肿瘤细胞是从正常细胞转化成的不受控制地无限增殖的细胞[1]。正常细胞的分化是有序、有限和有选择的基因表达，而肿瘤细胞出现分化缺失、阻断和异常，可以说，肿瘤就是一种细胞增殖和分化异常的疾病[2]。通过物理、化学或分子生物学的方法，“诱导分化”和/或“诱导逆转”逐渐成为肿瘤研究领域的热点。蜂毒素（Melittin）是蜜蜂毒的主要成分，为26个氨基酸组成的碱性多肽，生物活性高，对多种肿瘤细胞有杀伤作用[3-4]。本研究拟观察低剂量蜂毒素处理人肝癌细胞后对细胞恶性表型的影响，初步探讨其抑制肿瘤细胞作用可能的发生环节。

1 材料

1.1 试剂与药品： 蜂毒素为本科实验室采用凝胶色谱法纯化制备（纯度97%）；全反式维甲酸（ATRA）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）为美国Sigma公司产品； RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产品；刀豆蛋白（ConA）为上海华舜生物公司提供；甲胎蛋白单克隆抗体酶免检测试剂盒为瑞典CanAg公司产品；C-myc基因一抗为Santa Cruz公司产品。

1.2 细胞株： 人肝癌Bel-7402细胞株引自中国科学院上海细胞研究所，由长海医院中医科保存，常规接種于含100ml/L小牛血清的RPMI-1640完全培养基中，在37℃，50 ml/L CO2饱和湿度条件下培养，取生长期细胞进行实验。

2 方法

2.1 细胞增殖抑制及生长曲线： 将人Bel-7402细胞以1×105/ml接种于24孔板中，24 h细胞贴壁后，分别加入浓度为2μg/ml和4μg/ml的蜂毒素，阳性对照为10μmol/l的全反式维甲酸，阴性对照组加入等体积RPMI-1640培养基，每个组别24孔×2板，于处理后取7个时间作用点（12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h）及1天-8天时，每个浓度各取3孔，用血细胞计数板，光镜下计数活细胞数，计算抑制率。

2.2 刀豆蛋白（ConA）凝集试验： 取相应处理组细胞，稀释至浓度为1×105/ml，取无菌96孔板，按相应组别，分别向各孔中加入单细胞悬液100μl；再加入不同浓度（100、50、20、10、5μg/ml）的刀豆蛋白A（ConA）溶液；置37℃环境中，振荡器上振荡15min，倒置显微镜下观察凝集情况。

2.3 平皿克隆形成试验： 取生长良好的Bel-7402细胞，稀释成200个/ml.接种在24孔无菌培养板中，每孔0.9ml，每组设3个平行对照，待细胞贴壁后，加入相应药物，阴性对照加等体积PBS，继续培养10天后作克隆计数，每50个细胞为一个克隆并照相。克隆形成抑制率=（对照组克隆数-实验组克隆数/对照组克隆数）×100%。

2.4 甲胎蛋白含量测定： 取生长状态良好的Bel-7402，稀释后加于无菌200ml培养瓶中， 24 h细胞贴壁后，给予相应药物及对照处理，于第1、3、5、7日收集培养液，真空冷冻干燥，检测时溶于等体积PBS中。按照甲胎蛋白（AFP）检测试剂盒的操作要求，以酶联免疫检测仪，检测波长在450nm颜色吸光度，产生的颜色深度与标本中AFP的量呈正比。

2.5 c-myc基因表达： 无菌6孔板内置载玻片，贴壁后给予相应药物处理，每组取3片，培养5天后，95%乙醇固定。在固定好的细胞爬片上依次加入1：100稀释的鼠抗人c-myc单克隆抗，生物素标记的二抗，辣根过氧化物酶标记的链霉卵蛋白共同孵育，DAB显色剂室温显色，乙醇脱水后封片，200倍光学显微镜下观察。

2.6 统计学处理： 数据用x±s表示，SPSS 17.0统计软件进行分析，经过方差齐性检验后，方差齐性采用单因素方差分析 （One-way ANOVA）、多重比较采用 LSD法，计数资料进行描述性分析。P<0.05表示差异有显著意义，P<0.01表示差异有非常显著意义。

3 结果

3.1 细胞增殖及生长曲线： 在12h，24h蜂毒素对细胞株的增殖已有不同程度的抑制，ATRA对细胞几乎无作用；48h时，ATRA的抑制作用开始出现，随着作用时间的延长，Mel组与ATRA组对细胞的抑制均随之增强；120h时，ATRA较前一时间点抑制率降低，Mel组仍保持增强（P<0.05）；144h，各组抑制率均较120h时低。同时，如图1所示：阴性对照组细胞呈快速上升趋势，至第5d左右趋于平稳；经过不同浓度蜂毒素及ATRA处理后，细胞生长曲线上升速率变慢。ATRA处理组的生长曲线斜率介于Mel-2组和Mel-4组之间。第7天起，各组细胞总数均有所回落。

3.2 刀豆蛋白（ConA）凝集试验：如表1所示，处理后的Bel-7402细胞在同等浓度的ConA环境中，凝集阳性率明显降低。在Mel-4组中几乎丧失了凝集能力。

3.3 平皿克隆形成试验： 阴性对照组克隆形成率在95%以上，处理各组克隆数较阴性组明显降低（p<0.01），且单一克隆细胞数明显少；蜂毒素两个浓度之间也有差异，浓度高的4μg/ml蜂毒素组克隆形成数更少。

3.4 甲胎蛋白含量测定： 各组AFP分泌量均呈波浪形变化，培养第1天处于较低水平，各组间差别不大（p>0.05），提示Bel-7402细胞在贴壁过程中较少分泌AFP；培养及药物处理第3天，AFP含量达高峰，第5天跌落。与阴性对照相比，相同处理天数，药物作用后AFP分泌量显著减少（p<0.05）；各个药物处理组之间，以Mel-4组含量最低，ATRA组次之；ATRA组与Mel-2之间没有显著差异（p>0.05）。（表2）

3.5 c-myc基因表达： 阴性对照组中c-myc基因在Bel-7402细胞株中呈强阳性表达，主要分布于细胞核及核周边的细胞质区域，染成棕褐色，呈斑片或颗粒状。经蜂毒素处理后，细胞内c-myc基因表达减弱，阳性细胞数减少。在Mel-4组，见到的阳性细胞很少，呈淡黄色细小颗粒，分布于胞质紧靠核的区域，在细胞核内几乎不表达。在ATRA组，c-myc基因表达也减弱，呈浅棕黄色颗粒，在核内表达较阴性对照明显下降，但稍多于Mel-4组。

4 讨论

细胞分化的发生是由于遗传物质选择性的表达差异导致了来源相同的细胞形态、功能出现了差别，诱导分化是肿瘤综合治疗的新手段，是指在某些因素的作用下，细胞的恶性行为降低，形态学趋向成熟，主要从增殖能力、细胞形态、功能变化、粘附聚集及相关基因表达方面进行研究。以往我们的实验结果表明，蜂毒素在小剂量时对肿瘤细胞的杀伤作用减弱，抑制增殖及诱导凋亡的作用增强[5]。本实验中，以2μg/ml和4μg/ml浓度的蜂毒素处理人Bel-7402细胞后，细胞总数减少但活细胞率保持在较高水平，细胞生長曲线上升速率变慢，进一步证实低剂量蜂毒素对细胞增殖的影响不是通过细胞毒效应介导的。同时，实验结果也与肝癌细胞恶性程度密切相关的细胞凝集反应、克隆形成能力及分泌甲胎蛋白含量，经蜂毒素处理后，均出现明显降低，与空白对照组存在显著差异，部分结果优于阳性对照ATRA。

c-myc蛋白是一种核内蛋白，是c-myc基因的表达产物，具有转录调控作用，几乎所有增殖旺盛的细胞均有表达，其正常功能是使细胞产生增殖的未分化状态，其异常的高表达可能使细胞产生分化不良，这是许多恶性肿瘤细胞的共性。本实验中，经蜂毒素处理后的人Bel-7402细胞c-myc基因表达明显降低，细胞核内表达几乎缺失，故推测影响c-myc的表达可能是蜂毒素诱导人Bel-7402细胞分化转变的作用环节之一，确切的作用机制值得进一步探讨。当然，诱导细胞分化或逆转是一个复杂的过程，可能是多通道、多靶点的综合事件[7]，蜂毒素对此过程的影响仍需深入研究，值得我们做更多的工作，为在天然小分子物质中寻找有效的诱导分化物提供新依据和思路。

参考文献

[1]郑杰编著.肿瘤的细胞和分子生物学[M].上海科学技术出版社，2011.

[2]詹启敏编著.分子肿瘤学[M].人民卫生出版社，2005.

[3]陈永强，朱振安，郝永强，戴尅戎，，张晨.蜂毒素诱导骨肉瘤细胞U2OS凋亡与坏死的实验研究.中西医结合学报，2004.

[4]张晨，李柏，黄雪强，张亚妮，苏永华，凌昌全.蜂毒素对肝癌细胞BEL-7402的增殖抑制作用.浙江中医药大学学报.2007，3l（5）：560-564.

[5]张晨，李柏，吕书勤，李勇，苏永华，凌昌全.蜂毒素对人肝癌细胞线粒体膜蛋白7A6和凋亡相关基因产物Fas及其配体FasL表达的影响.中西医结合学报，2007，5（5）：559-563.

[6]Bosch A，Bertran SP，Lu Y，Garcia A，Jones AM，Dawson MI， Farias EF.Reversal by RARα agonist Am580 of c-Myc-induced imbalance in RARα/RARγ expression during MMTV-Myc tumorigenesis.[J].Breast Cancer Res.2012.

[7]Jo M，Park MH， Kollipara PS，An BJ，Song HS. Anti-cancer effect of bee venom toxin and melittin in ovarian cancer cells through induction of death receptors and inhibition of JAK2/STAT3 pathway.[J].Toxicol Appl Pharmacol.2012.