人的炎症牙周膜干细胞和牙周膜干细胞的体外分离、培养与鉴定

蒋松阳

【摘要】 目的 体外分离培养人的炎症牙周膜干细胞和正常的牙周膜干细胞，并从形态学和表面分子表达率比较两种细胞的差别，为体外分离、培养炎症牙周膜干细胞提供理论依据。方法 体外酶消化组织块法培养牙周炎患者的炎症牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常的人的牙周膜干细胞（PDLSCs），体式显微镜下观察细胞表面形态，流式细胞仪检测表型分子CD90、CD29、CD105、CD31、CD45、STRO-1进行干细胞鉴定。

【关键词】 牙周膜干细胞；炎症

【中图分类号】R781.4 【文献标识码】A 【文章编号】1004-4949（2013）06-11-03

牙周炎导致牙周支持组织破坏，是成人失牙的主要原因[1]。牙周治疗的主要目的是控制牙周组织炎症，维护牙周组织健康，并使包括牙槽骨、牙骨质、牙周膜、牙龈在内的牙周组织达到形态和功能上的再生与重建，这也是牙周病治疗的终极目标[2-4]。近年发展起来的组织工程技术为牙周组织再生治疗开辟了新途径，种子细胞、信号分子和支架是牙周组织工程技术的三大要素，因此合理选择种子细胞是牙周组织工程技术获得成功的关键[5-6]，目前已确认可用于牙周组织工程技术的种子细胞有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和牙周膜干细胞等[7-9]，其来源多为健康的人体组织，通常存在取材有创、来源有限等弊端，在一定程度上限制了临床治疗的可行性。许多研究表明在牙周炎时期也存在着组织的再生，而组织的再生离不开干细胞的迁移，只有适当类型的干细胞附着于根面，增殖并分化为功能性附着结构（牙骨质-牙周膜-牙槽骨）的各种细胞组分，配合适宜的刺激因子和基质成分，才可能形成再生组织，否则可能仅产生修复[10]。Lin 等[11]对3名重度牙周炎（Ⅲ度根分叉病变）患者需要拔除的患牙行 GTR 手术，术后6周，切取其中2名患者患牙周围的再生组织，进行免疫组化检测，发现了STRO-1、CD146 和CD44 阳性的细胞，同时拔除余下1名患者的患牙，取其再生组织进行细胞体外培养并传代，用流式细胞仪分析得到 STRO-1、CD146 和 CD44 阳性的细胞百分比分别为78.3%、94.9%和100%，所得细胞经矿化和成脂诱导 4周后可分别形成矿化结节及脂滴，但其分化能力低于PDLSCs 和BMSCs。该实验证明了牙周炎症再生组织中应该存在具有干细胞特性的细胞。Chen 等[6]将临床上因重度牙周炎而拔除的患牙制成组织切片，使用免疫组化染色观察发现，在牙周炎患牙的牙周组织中，STRO-1、CD146 和CD44 阳性细胞分布情况与健康牙周组织近似，而牙周膜干细胞表面的阳性标记物是STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD105、阴性标记物是CD31 CD45，所以本实验利用STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD105、和CD31 CD45对牙周膜干细胞和炎症牙周膜干细胞（i-PDLSCs）进行鉴定。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

1.2 主要器械： 眼科剪、眼科镊、刀柄、11 号刀片、平底培养皿、25cm2培养瓶、10ml离心管、平底 6 孔板（Corning，美国）、金属滤器。

1.3 主要实验仪器

1.4 实验方法

1.4.1 原代细胞的培养： 1）炎症牙周膜干细胞的培养（iPDLSCs）：取材：选取临床上年龄在 30-45 岁之间的慢性牙周炎患者，收集其因重度牙周炎需要拔除的患牙，患牙无牙根吸收、根尖周炎和根尖囊肿等牙髓和根尖周疾病，刮取其炎症牙周膜组织；漂洗组织：将获得组织用 8 万 U 庆大霉素浸泡 3-5min，用 PBS 反复漂洗 3 遍，将其剪成约 2mm×2mm×2mm 大小的组织块；消化与接种：把漂洗后的组织块收集到離心管中，然后加入1-2ml胶原酶，置于含有5% CO2、37℃二氧化碳培养箱中消化，每15min 摇动离心管一次，40min后拿出，然后吹打均匀，以800rpm 离心 6min，弃去上清液，加入2ml培养液（含10%胎牛血清、200U/ml 庆大霉素和 100U/ml 青霉素的α-MEM，下同）再次吹打均匀，接种于 6孔板中，置于二氧化碳培养箱中培养（5% CO2，37℃），每3d换液一次。2）健康牙周膜干细胞的培养（PDLSCs）：取材：选取临床上年龄在 20-35 岁之间的非牙周炎患者，收集其因正畸需要所拔牙齿或拔除的无炎症的阻生第三磨牙，刮取其根中部 1/3 牙周膜；消化与接种：将获得组织用 PBS 漂洗 3 遍，余步骤同上。

1.4.2 细胞的纯化： 本次试验使用有限稀释法对iPDLSCs和PDLSCs进行纯化，显微镜下观察原代细胞铺满6孔板底达 80%汇合时，弃去原培养液，用PBS 冲洗2遍，然后加入胰蛋白酶2ml消化2-3min，镜下见细胞团漂浮在液体之上时加入等量的培养液终止消化，反复吹打数次后将细胞悬液转移到离心管中，以800rpm 离心6min，弃上清，加入适量培养液进行倍比稀释，调整细胞密度至 10-20个/ml，以 1-2 个/孔的密度接种于96孔板，每孔加入培养液100μl，次日挑选出单个细胞孔，将培养液加至200μl继续培养，每3d 换液1次，待细胞长满孔底 1/3-1/2时消化并接种培养瓶，常规培养传代。

1.5 流式细胞仪表面分子鉴定： 取筛选培养的人牙周膜干细胞和炎症牙周膜干细胞，弃原培养液，PBS冲洗两遍，用胰蛋白酶2ml消化1min，α-MEN中和消化，1000r/min离心6min，弃上清，用含30%胎牛血清的PBS缓冲液将牙周膜细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度4.0x105/L，每个Eppendof管加400ul的细胞悬液，室温下分别避光加入CD45-PE、CD31-PE、CD90-PE、STRO-1-FITC、CD29-FITC、CD105-PE小鼠抗人单克隆抗体2ul，4℃冰箱避光孵育2h，用含30%胎牛血清PBS缓冲液清洗细胞两到三遍，1000r/min离心5min，将细胞重悬于含30%胎牛血清PBS中，使用同型对照单克隆抗体确定背景标记，用流式细胞仪分析荧光细胞，专用配套软件计算细胞表面抗原阳性率，单位用%表示。

2 结果

2.1 原代细胞生长情况： 使用酶消化组织块法原代培养iPDLSCs 和 PDLSCs，接种3-7d后可以看到有细胞从组织块周围爬出，在远离组织块的地方也有数个细胞爬出，大部分细胞大小均一，为成纤维细胞样，呈长梭形，少数细胞体积较小，呈多角形或椭圆形，胞浆丰满，两种细胞形态无明显差异，PDLSCs接种2w 左右达80%汇合，iPDLSCs 接种 3w 左右达80%汇合。（图1、2）

2.2 细胞纯化情况： 炎症牙周膜干细胞接种 96孔板后25d左右，约20%的单细胞孔细胞形成克隆并增殖铺满孔底 1/3-1/2，细胞排列密度大，细胞体积略小，呈梭形，9d左右可传代一次。

健康牙周膜干细胞接种96孔板后15d左右，约30%的单细胞孔细胞形成克隆并增殖铺满孔底 1/3-1/2，细胞形态与炎症牙周膜干细胞无明显差异，7d左右可传代一次。

2.3 流式细胞仪表面分子鉴定： 分离得到的PDLSCs和iPDLSCs具有干细胞的分子表型和较高的纯度（图3），即均表达间充质干细胞分子阳性（STRO-1、CD29、CD105、CD90），（CD31、CD45）为阴性，其中PDLSCs表面分子CD105的阳性表达率为26.6%（图A-1）、CD29的阳性表达率为96.1%（图A-2）、STRO-1的阳性表达率为5.4%（图A-3）、CD90的阳性表达率为85.2%（图A-4），iPDLSCs表面分子CD105的阳性表达率为50.2%（图B-1）、CD29的阳性表达率为95.3%（图B-2）、STRO-1的阳性表达率为7.0%（图B-3）、CD90的阳性表达率为85.8%（图B-4）

3 讨论

牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）是来源于牙周膜的成体干细胞，具有自我更新能力，能够被诱导形成多种组织细胞，能够维持牙周膜功能的稳定，发挥生理性细胞更新和修复组织损伤的作用[12-13]。近年来许多学者利用PDLSC体外培养模型，在牙周组织疾病的发病机制及治疗研究等方面取得了一定进展，如何获取大量的人牙周膜干细胞，是建立体外研究模型的关键之一。目前牙周膜细胞的分离培养主要有酶消化法和组织块法，其中组织块法被广泛采用，但是它的培养成功率较低，近年来有些研究表明利用酶消化组织块法来培养牙周膜干细胞，可以提高原代细胞培养的成功率[14]，采用该法我们成功培养出人炎症牙周膜干细胞的原代，原代培养成功率达到了50%。

为了获得更多的干细胞，我们采用传统方法对原代炎症牙周膜干细胞和健康牙周膜干细胞进行了纯化，即对炎症牙周膜干细胞和健康牙周膜干细胞进行有限稀释法，挑选单细胞克隆，继而扩大培养，克隆化生长的能力至少满足了干细胞应具有克隆形成能力这一条件，为我们的鉴定工作奠定了一定的基础，同时我们采用流式细胞技术来鉴定炎症牙周膜干细胞和健康牙周膜干细胞的表面分子，结果表明STRO-1、CD29、CD105、CD90为阳性表达，CD31、CD45为阴性表达，并且两种细胞的表面分子表达率并没有明显的不同。

4 结论

用酶消化组织块培养牙周膜干细胞，能提高牙周膜干细胞的培养成功率；炎症牙周膜干细胞和健康牙周膜干细胞的细胞形态基本相同；流式细胞仪鉴定结果表明本实验培养、分离的PDLSCs和iPDLSCs具有干细胞的特性，并且两种细胞的表面分子表达率并没有明显的不同。

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