卡拉库尔羊TNF—α基因原核表达载体的构建及表达条件优化

贺艳艳　潘辉　王娟娟等

摘要：利用反转录PCR（RT-PCR）技术扩增卡拉库尔羊肿瘤坏死因子α（TNF-α）基因，连接到pET-28b载体，转化大肠杆菌BL21（DE3），在不同的IPTG浓度、时间、温度条件下诱导TNF-α的表达。结果表明，原核表达载体pET-28b-TNF-α构建成功，可在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，优化的诱导表达条件为诱导温度37 ℃、诱导时间4 h、IPTG浓度1.0 mmol/L。

关键词：肿瘤坏死因子α（TNF-α）；原核表达；表达条件

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）07-1686-03

肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）是一类具有多种生物学活性的细胞因子，在体内具有特异性杀伤肿瘤细胞、免疫调节、抗病毒、抗寄生虫、代谢调控、造血及炎症前反应等多种作用[1-3]。近年来对TNF-α及其阻断剂在临床应用方面的研究获得了可喜的成果[4-7]。本研究通过反转录PCR（RT-PCR）技术扩增卡拉库尔羊TNF-α基因，构建重组质粒pET-28b-TNF-α转化大肠杆菌（E. coli）BL21（DE3）菌株，对TNF-α的表达条件进行优化，以期为研究卡拉库尔羊TNF-α在机体内的作用、生物学活性及其在动物疾病治疗、饲料开发等方面的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）菌株、表达载体pET-28b（+）均由新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室保存；Taq DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、X-Gal、IPTG、dNTPs、DNA Marker、PrimeScript Reverse Transcriptase试剂盒等购自宝生物工程（大连）有限公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵（AP）、Tris、TEMED等购自生工生物工程（上海）股份有限公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒和AxyPrep质粒DNA小量试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pET-28b-TNF-α的构建与鉴定 提取卡拉库尔羊淋巴细胞总RNA，反转录获得cDNA，PCR扩增TNF-α基因，上下游引物分别为PF， 5′-GGCGAATTCCTCCCGTCTGGACTTGGATC-3′（划线部分为EcoR Ⅰ酶切位点）；RF， 5′-GGCCTCG

AGGGACACCTTGACCTCCTGAAT-3′（划线部分为Xho Ⅰ酶切位点）。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切PCR产物和pET-28b原核表达载体。回收后用T4连接酶连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5α中培养，挑取阳性克隆进行酶切及测序鉴定。

1.2.2 卡拉库尔羊TNF-α融合蛋白的诱导表达 将重组质粒pET-28b-TNF-α转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，在含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中摇菌过夜，后取1 μL转接到100 μL新鲜的含50 mg/L卡那霉素的LB培养基。分别在不同的诱导温度（37、39、42 ℃）、时间（1、2、3、4 h）和IPTG浓度（0.5、1.0、1.5 mmol/L）条件下进行TNF-α融合蛋白的诱导表达。诱导表达后收集1 mL表达菌，4 ℃、12 000 r/min离心1 min，弃上清，加入2×SDS缓冲液20 μL和2 μL 二硫苏糖醇（DTT），涡旋混匀，12 000 r/min离心1 min，100 ℃加热5 min以使蛋白质变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测表达的融合蛋白[8]。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR扩增卡拉库尔羊TNF-α基因

以卡拉库尔羊淋巴细胞RNA为模板，反转录获得cDNA，利用设计好的引物扩增得到卡拉库尔羊TNF-α基因，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果见图1。从图1可以看出，扩增产物条带清晰明亮，长度约为1 300 bp，与预期目标片段大小相符，测序结果表明得到的扩增产物长度为1 268 bp，与已知的TNF-α基因序列一致。

2.2 卡拉库尔羊重组原核表达质粒pET-28b-TNF-α的鉴定

将构建的重组原核表达质粒pET-28b-TNF-α转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，挑单菌落进行菌液PCR鉴定，对阳性菌落提取质粒进行EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定，结果见图2。从图2可以看出，质粒双酶切后得到明显的两条条带，大小分别为1 300 bp和5 000 bp左右。

2.3 TNF-α融合蛋白的诱导表达

将含有表达载体pET-28b-TNF-α的大肠杆菌BL21（DE3）菌株在不同温度和时间条件下培养，添加不同浓度的IPTG进行TNF-α融合蛋白的诱导表达。SDS-PAGE检测表达产物，结果见图3。采用BandScan 5.0软件对电泳结果进行分析，结果表明诱导温度37 ℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导4 h时的蛋白表达量较高，占菌体蛋白表达量的21.6%（图4）。

3 小结与讨论

大肠杆菌BL21（DE3）表达系统是一个便捷的、能在体外高效表达真核基因的系统，该系统不能进行蛋白质的翻译后修饰，因而对外源基因表达后大多数产物通常以包涵体形式存在，导致蛋白没有活性。但大肠杆菌BL21（DE3）系统能让研究者获得较满意的蛋白表达量，从而为以后的实验提供大量的蛋白原料。

在原核表达系统中除了需要表达菌株，还需要表达载体，pET系列载体在原核表达载体中较为常用，可利用诱导剂IPTG对外源蛋白的表达进行调控。本实验选用了技术非常成熟的融合型原核表达载体pET-28b，pET-28b全长5 369 bp，带有卡那青霉素抗性筛选基因，该载体包括T7启动子、LacZ操纵子序列、LacI调控基因、多克隆位点等。该载体还含有6个组氨酸标签，当用Ni-NTA树脂纯化蛋白时，6个组氨酸标签与其有很强的亲和性，这样有利于蛋白的纯化。此外，融合表达能提高目的蛋白的表达量，降低外源蛋白对表达宿主菌细胞的毒性。

影响蛋白表达的因素很多[9-15]，本研究只选择了3个，即诱导温度、诱导时间和IPTG浓度。温度和时间是影响融合蛋白诱导表达的重要因素，选择合适的诱导温度和时间可以促进菌体的生长，提高产物的表达量。但培养时间过长会导致菌体代谢产生的毒素积累，从而影响菌体生长，降低蛋白的表达水平。IPTG对蛋白的表达有促进作用，其浓度过高也会抑制大肠杆菌的生长。本试验结果表明，卡拉库尔羊TNF-α融合蛋白在37 ℃、1.0 mmol/L IPTG的条件下诱导4 h，表达量达最高。

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