响应面法优化 对虾虾头蛋白酶酶解工艺

王媛

中国对虾（Fenneropenaeus chinensis），又称东方对虾，是我国分布最广的对虾类。中国对虾是中国的特产，因其营养丰富，滋味鲜美，且具保健功能，是我国重要的出口水产品，广受国际市场欢迎。而在虾类加工过程中，大量的虾头被当作废物丢弃，既浪费了资源，又对环境造成极大的污染。虾头中富含蛋白质，同时游离氨基酸的种类较齐全，含量丰富，尤其是呈鲜味和甘味氨基酸，是提取优质蛋白的良好原料。用酶解技术获得的对虾虾头酶解液含有大量的游离氨基酸，可以用于调味品的增香，提高鲜度，增加风味料的浓度，是调味珍品。

本文以中国对虾虾头为原料，研究碱性蛋白酶酶解温度、酶解pH值、酶与底物比对虾头水解度的影响，以期得到虾头酶解的最佳工艺条件并为虾头废弃物综合利用提供技术支持。结果表明，虾头酶解的最佳工艺条件为：酶解温度62.0℃、酶解pH值9.1和酶与底物比1988U/g；经验证此条件下虾头酶解液水解度达到24.08%，与预测值24.38%基本相符。

材料与仪器

新鲜中国对虾虾头（收集于赣榆县农贸市场，洗净，晾干表面水分，用高速组织捣碎机粉碎备用）；柠檬酸、氢氧化钠、甲醛、盐酸等试剂（国产分析纯）；碱性蛋白酶（国产食品级生化试剂，测定活力为2.95X104U/g）。

AB104-N分析天平（梅特勒-托利多）；HH.CP-101型恒温水浴箱（上海贺德）；GS-100S型高速离心机（上海贺德）；DS-1型高速组织捣碎机（上海标本模型厂）；101A-1型电热鼓风干燥箱（上海市试验仪器总厂）；SW-CJ-1F型超净工作台（苏州安泰技术公司）；DZHH-5型电动试管振荡器（上海贺德）；BCD-205UT型电冰箱（青岛海尔）；PHS-3C精密PH计（上海精密科学仪器）；其他常规玻璃仪器。

实验方法

1.虾头成分测定

（1）水分：采用105℃恒重法（GB 5009.3-2010）；

（2）灰分：采用高温灼烧法；

（3）蛋白质含量的测定：采用GB 5009.5-2010中的凯氏定氮法测定；

（4）脂肪含量的测定：采用GB 5009.6-2003中的索氏抽提法。2.总挥发性盐基氮的测定

采用微量扩散法。

3.游离氨态氮

采用甲醛电位滴定法。

4.水解度（DH）的测定

采用以下公式计算：DH（%）=（FANFAN0）×100/（N1-FAN0）；式中FAN0为虾头的游离氨基态氮；FAN为酶解液中的游离氨态氮；N1为总氮。5.酶解工艺流程

虾头浆→加水调pH→恒温水浴振荡酶解→粗过滤→钝化酶（沸水浴10min）→离心→取上清液过滤→DH测定。

6.操作要点

（1）通过对比酸性蛋白酶（酶解温度55℃、pH5.0）、中性蛋白酶（酶解温度55℃、pH7.0）、碱性蛋白酶（酶解温度60℃、pH9.0）和木瓜蛋白酶（酶解温度50℃、pH5.5）4种蛋白酶的生物活性，并以水解度（DH）、总挥发性盐基氮（TVBN）和酶解液风味的感官评定作为主要评价指标，筛选出最佳水解酶为碱性蛋白酶。

（2）依据单因素实验结果并参考经验值，固液比不是影响对虾头酶解工艺的主要因素，确定固液比为1∶2。

（3）总挥发性盐基氮（TVBN）是指肉、鱼类样品浸液在弱碱性下能与水蒸汽一起蒸馏出来的总氮量，主要是氨和胺类（三甲胺和二甲胺），常用蒸馏法或Conway微量扩散法定量。一般氨基酸、蛋白质类等含氮高的食品，如鱼、虾、贝类及肉类，在需氧性败坏时，常以测定挥发性盐基氮含量的多少作为评定的化学指标。通过实验过程的TVBN值测定与感官判断相结合，发现当TVBN值超过45mg/100mL时，水解液已有异味出现，这主要是由于虾头中微生物形成产物腐败所致。所以，当TVBN值达到45mg/100mL时停止水解。

7.响应面法优化试验

根据单因素试验结果，试验选取碱性蛋白酶酶解温度（55℃、60℃、65℃）、酶解pH值（8.5、9.0、9.5）、酶与底物比（1750U/g、2000U/g、2250U/g）3个因素为自变量，以TVBN值达到45mg/100mL时的水解度为响应值，并根据BoxBenhnken模型的中心组合试验设计原理，采用响应面法设计3因素3水平的响应分析试验，各因素水平编码值见表1。

比较图1～3并结合表4中p可知：删除不显著项AB、BC，所以将上述回归方程修正为：Y=23.91+1.26A+1.47B-0.73C-1.68AA+0.41AB-2.85BB-1.25CC。通过计算得到最佳工艺参数为酶解温度62.0℃、酶解pH值9.1和酶与底物比1988U/g。

3.优化工艺的验证

为检验Box-Benhnken模型试验设计所得结果的可靠性，采用上述优化出的工艺参数重复实验3次，实际测得的平均水解率为24.08%，与预测值24.38%基本相符。因此，Box-Benhnken模型试验设计所得的最佳工艺参数准确可靠，具有实用价值。

结 论

在单因素试验基础上，根据BoxBenhnken模型试验设计原理，选取酶解温度、酶解pH值、酶与底物比为试验影响因素，以虾头水解度为响应值，对试验数据进行回归拟合，得到酶解温度、酶解pH值、酶与底物比3个因素的二次多项回归模型，对回归模型进行分析，得出虾头酶解最佳工艺为：碱性蛋白酶作为水解酶，酶解温度62.0℃、酶解pH值9.1和酶与底物比1988U/g。在该条件下虾头的水解度为24.38%。为了验证最佳工艺条件，在此条件下测得虾头实际水解度为24.08%，与理论预测值的误差为1.2%，说明采用该法优化得到的虾头酶解工艺可靠。