索拉非尼联合希罗达对肝癌抑制作用的实验研究

王亮 赵家泉

【摘 要】目的：检测索拉非尼单药、希罗达单药以及两药联合应用对肝癌细胞株PLC以及肝癌移植瘤动物模型的生长抑制作用，探讨两药联合应用的协同抗肿瘤机制。方法：设不同浓度的索拉非尼和不同浓度的希罗达单药组，及索拉非尼+希罗达联合用药组，以不加药组作为对照组，分别观察其对肝癌细胞株PLC的生长抑制作用。MTT法检测索拉非尼、希罗达单药及联合应用对肝癌细胞株PLC的增殖抑制作用。BALB/C裸鼠皮下接种肝癌PLC细胞建立肝癌移植瘤动物模型，随机分成索拉非尼、希罗达单药组和索拉非尼+希罗达联合用药组，另设以不加药组作为对照组，观察各组肿瘤生长情况，免疫组织化学法检测各组移植瘤组织内的VEGF表达情况。结果：索拉非尼、希罗达单药与联合应用均能抑制PLC细胞增殖，呈剂量-时间依赖效应，联合组的抑制作用更强（P<0.05），两药联用有协同效应。与对照组比较，索拉非尼、希罗达单药组及联合用药组的肿瘤体积和肿瘤质量均显著减少，P<0.05；联合应用组的肿瘤体积和肿瘤质量较索拉非尼及希罗达单药组显著减少，P<0.05。与对照组相比，索拉非尼、希罗达单药组和联合用药组VEGF表达明显减少，P 值分别为0.018、0.029和0.013；与索拉非尼、希罗达单药组相比， 联合用药组VEGF的表达下降更明显，P 值分别为0.046 和0.036。结论：索拉非尼及希罗达对肝癌细胞株PLC均有抑制增殖作用，联合抑制作用更强，表现为协同作用。体内实验证实索拉非尼和希罗达可抑制裸鼠肝癌细胞移植瘤的生长，两药联合的效应更明显，可协同降低VEGF的表达。

【关键词】索拉非尼；希罗达；肝癌

肝细胞性肝癌是世界范围内发病率较高的恶性肿瘤之一，我国是世界上肝癌的高发地区，其发生率约为30.3/10万[1]，目前手术切除仍是治疗肝细胞性肝癌的首选方法。但是大多数患者在就诊时己是晚期，而那些行肝癌根治性切除后病人的5年复发率高达61.5%，小肝癌的术后复发率为43.5%[2]，肿瘤术后复发成为目前肝癌临床治疗的难题。因此，寻找一种有效的非手术治疗方法来治疗或辅助治疗肝细胞性肝癌具有重要意义。近年来，分子靶向药物治疗肝细胞性肝癌已成为新的研究热点， 受到高度的关注。索拉非尼是一种双芳基尿素类口服多激酶抑制剂，它具有双重抗肿瘤作用[3][4]。希罗达则是一种新型的选择性口服化疗药物，通过三步酶链反应在肿瘤细胞内被转化为5-FU，继而杀死肿瘤细胞。本研究探讨索拉非尼联合希罗达，对人肝癌PLC细胞和肝癌移植瘤的抑制作用，证实两药联合可以具有协同作用，为进一步的体内试验与临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株：人肝癌细胞株PLC， 购自中科院上海细胞库。培养传代于含10%新生牛血清的DMEM培养液中， 选择对数生长期细胞进行实验。

1.1.2 药物及试剂索拉非尼，由拜耳公司生产，应用100%DMSO溶解，于-20°保存，实验用时稀释，DMSO终浓度<0.5%。希罗达由上海罗氏有限公司生产；DMEM﹑胎牛血清﹑胰酶由南京都英科技有限公司购买；MTT及DMSO由Sigma公司生产。

1.1.3 实验动物： BALB/Cnu/nu雌性裸小鼠由南京大学实验动物研究所提供，鼠龄4-5周，体重17-20克，由鼓楼医院实验动物中心负责裸鼠室内培养。

1.2 MTT法检测药物对肿瘤细胞增殖的抑制

培养PLC细胞，取对数生长期PLC细胞，以5*103/孔的密度接种于96孔板，培养24h后加入药物。实验分组：索拉非尼（1.5 ，3，6umol/L）和希罗达（6，12，24umol/L）分别组成单药组和索拉非尼+希罗达联合用药组，另设不加药的对照组，作用于PLC细胞。每个剂量设5个复孔，加药后分别继续培养24、48、72h后每孔加入MTT（5mg/m1）10uL，继续培养4h。终止培养，弃上清，每孔加150 ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解，用酶标仪（波长570nm）测定各孔的OD值，计算细胞增殖抑制率。抑制率（%）=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×l00%。采用协同作用q 值判断索拉非尼和希罗达联用的性质。q值的计算公式为：q=EAB/（EA+EB-EA×EB）。式中EA和EB为各药单用抑制率， EAB为两药合用抑制率。q>1.15为协同作用，0.85≤q≤1.15为相加作用，q<0.85为拮抗作用。

1.3 建立荷人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型

培养人肝癌PLC细胞至对数生长期时，接种于裸鼠右侧腋窝皮下血供丰富的部位，注射肿瘤细胞悬液 （0.2ml/只），含活细胞107/0.2ml。

1.4 荷瘤裸鼠分组体内试验

将已成瘤的荷PLC移植瘤的裸鼠根据移植瘤的瘤积均衡选出40只，随机分成4组：

空白对照组：0.9%生理盐水胃管灌入0.2ml，每天一次，（第1-21天）。

索拉非尼单药组：0.9%生理盐水胃管灌入0.1ml，每天一次+索拉非尼40mg/Kg，胃管灌入0.1ml，每天一次，qd（1-21天）。

希罗达单药组：0.9%生理盐水胃管灌入0.1ml，每天一次+希罗达180mg/Kg，胃管灌入0.1ml，每天一次，qd（1-21天）。

索拉非尼联合希罗达组：索拉非尼40mg/Kg，胃管灌入0.1ml，每天一次+希罗达180mg/Kg，胃管灌入0.1ml，每天一次，qd（1-21天）。分别计算各组给药前1天和给药后第22天的肿瘤体积。

计算公式肿瘤体积长径×短径×短径/2。

1.5 裸鼠皮下移植瘤模型的标本采集及检测

实验的第22天，颈椎脱位处死裸鼠，把皮下移植瘤连同胞膜完整剥离出肿瘤组织，电子天平称取瘤重。收集肿瘤酒精固定，石蜡包埋，拼厚连续切片。肿瘤组织HE染色，免疫组织化学法检测各组移植瘤组织的VEGF的表达。

2 实验结果

2.1 索拉非尼和希罗达对PLC细胞增殖的抑制作用

MTT结果显示，索拉非尼或希罗达处理24、48、72h后，对PLC细胞生长均有一定抑制作用，表现为时间-剂量依赖效应。而两药联合应用后细胞抑制率明显增加，分别为单药组的1.56～4.13倍，差异有统计学意义（ P <0.05）。用factorial analysis分析两药联用的性质，结果显示为两药联用具有交互效应（P<0.05），且为协同作用。

2.2 在给药的第17﹑18天索拉非尼组和希罗达组各有l只死亡，经解剖发现系插胃管时误入气管所致。改正操作失误后未再有动物死亡。实验过程中各组裸鼠未见明显不良反应，饮食正常。

2.2.1各组给药前后皮下移植瘤的瘤积和瘤重结果

各组裸鼠的瘤积在给药前无显著性差异（P=0.275），用药后的各组瘤积和瘤重较对照组显著减少，差异有统计学意义（P<0.05）。联合组的瘤积和瘤重较单药索拉非尼组及希罗达组均显著减少，差异有统计学意义（P<0.05）。

对照组细胞内有棕黄色颗粒沉着，细胞染色多为阳性或强阳性，索拉非尼组、希罗达组及联合组沉着很少，细胞染色多为弱阳性。与对照组相比，索拉非尼、希罗达单药组和联合组VEGF表达明显减少， 差异有统计学意义，P 值分别为0.1018、0.1029和0.1013。与索拉非尼和希罗达单药组相比，联合组VEGF的表达下降更明显，差异有统计学意义，P 值分别为0.1046和0.1036。

3 讨论

索拉非尼是一种双芳基尿素类口服多激酶抑制剂，它具有双重抗肿瘤作用[3][4]。一方面通过抑制RAS / RAF / MEK / ERK信号传导通路直接抑制肿瘤生长，另一方面通过抑制几种与新生血管生成和肿瘤发展有关的酪氨酸激酶受体的活性，包括血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2），VEGFR-3，血小板衍生的生长因子受体-β（PDGFR-β）和c-KIT原癌基因，阻断肿瘤新生血管生成，间接抑制肿瘤细胞的生长，从而起到抗肿瘤作用。

希罗达（Xeloda）是新型的选择性口服化疗药物，通过三步酶链反应在肿瘤细胞内被转化为5-FU，继而杀死肿瘤细胞[5]。由于希罗达只被肿瘤组织内特有的TP酶激活而转化为活性物质，故对正常组织和细胞作用很小。细胞学部分的实验结果显示，单独应用索拉非尼与希罗达对PLC细胞均有生长抑制和诱导凋亡的作用，而且联合应用后提高了肿瘤细胞的抑制率和凋亡比例。肝细胞性肝癌是血管丰富的实体肿瘤， VEGF是目前发现的最重要的促血管生长因子，在肿瘤生长和转移中具有重要意义[6]。在本研究中发现索拉非尼治疗组VEGF的表达也显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。推测其对VEGF的抑制作用与MAPK通路的阻断有关。将索拉非尼和希罗达联合作用于肝癌裸鼠移植瘤模型，显示联合用药组VEGF 的表达也显著降低（P < 0.05）。抑瘤实验的结果也充分肯定了索拉非尼和希罗达对肝细胞性肝癌裸鼠移植瘤的生长抑制有协同作用。与索拉非尼单药和希罗达单药相比，两药联合能明显降低移植瘤的瘤体积和瘤质量（P < 0.05）。除了两者对肿瘤血管生成的联合阻断作用外，也有联合抑制肿瘤增殖的作用。

4 结论

4.1索拉非尼及希罗达对PLC肝癌细胞株均有抑制增殖作用，联合抑制作用更强，表现为协同作用。

4.2体内实验证实索拉非尼和希罗达可抑制裸鼠PLC肝癌细胞移植瘤的生长，两药联合的效应更明显，可协同降低VEGF的表达。

参考文献：

[1] Walsh P，ReitikA，VaughanD，et a1.CamobellsUrology[M].7thed.Harcourt Publishcrs Limited，1998；2360-4.

[2] Erichsen R， Jepsen P， Jacobsen J， et al. Time trends in incidence and prognosis of primary liver cancer and liver metastases of unknown origin in a Danish region， 1985-2004. Eur J Gastroenterol Hepatol 2008；20（2）：104-10.

[3] Larkin JM， Eisen T. Renal cell carcinoma and the use of sorafenib. Ther Clin Risk Manag 2006；2（1）：87-98.

[4] Wood LS， Manchen B. Sorafenib： a promising new targeted therapy for renal cell carcinoma. Clin J Oncol Nurs 2007；11（5）：649-56.

[5] Jim Cassidy， Josep Tabernero， XELOX （Capecitabine Plus Oxaliplatin）： Active First-Line Therapy for Patients With MetastaticColorectal Cancer. JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY.VOLUME 22 NUMBER 11 JUNE 1 2004.

[6] 江忠清，朱凤川，曲军英. 宫颈癌组织中Endogiin 和VEGF 表达与血管生成和癌细胞增殖及侵袭转移的关系[J].中华肿瘤防治杂志，2007，14 （21）：163921643.