SDS—PAGE方法分析暹罗鳄鱼肉差异蛋白

王凤林 何慧丽 李耀武 李瑾瑾 王春梅

【摘 要】 目的：分析暹罗鳄鱼肉与鱼肉、鸡肉、猪肉中蛋白的差异，找出鳄鱼肉特异蛋白。方法：采用电泳缓冲液匀浆鳄鱼肉、鱼肉、鸡肉和猪肉，反复冻融5次后，得到4种动物肉匀浆液，采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法，对4种动物肉进行差异蛋白研究。结果：以13%的分离胶、60ug蛋白量上样，大板（16cm*20cm）进行SDS-PAGE，4种动物肉的电泳谱带有明显差异，鳄鱼肉存在特征条带。结论：鳄鱼肉中差异蛋白较多，此方法可以用于鉴别鳄鱼肉。

【关键词】暹罗鳄鱼肉；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；电泳；特征谱带

暹罗鳄（Siamese crocodile）隶属爬行纲、鳄鱼目、鳄科，具有繁殖能力强、生长快、抗病力强、皮质优良等优点。现代医学研究证明，鳄鱼肉含有丰富的优良蛋白质和人体必需的氨基酸、不饱和脂肪酸、维他命及各种微量元素[1]。鳄鱼肉不但味道鲜美，而且能补气血、壮筋骨、治哮喘、滋心养肺，对慢性咳嗽、糖尿病也有显著疗效。另外，由于鳄鱼肉含有高效抗体和奇特构造的血红蛋白，可以极快地提高人体免疫力和血液摄氧能力，改善机体缺氧症状[2-3]，因此，鳄鱼肉很可能具有医疗保健作用。但是鳄鱼肉是否含有不同于较廉价的常规食品肉类的特异的蛋白呢？如果作为保健品开发，如何进行质量控制呢？

本研究拟采用SDS-PAGE的方法，运用凝胶定量软件Quantity One，对鳄鱼肉和其他3种动物肉中蛋白差异条带进行电泳分析，从而找到鳄鱼肉与其他动物肉之间的差异特征条带，以作为鳄鱼肉及其他动物肉的鉴别依据，为鳄鱼肉保健品的开发研究奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 样品来源 暹罗鳄鱼肉由北京洪源澳达生物技术发展有限公司提供，鲫鱼肉、鸡胸肉、猪肉采购自花家地南街菜市场。

1.2 仪器 BS323S电子天平（德国赛多利斯股份公司），移液器（Eppendorf公司），I-13型台式高速冷冻离心机（Sigma公司）， UV-2100型紫外可见分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司），电热恒温水浴锅（北京市北方照明电器工程公司），PAC3000型稳压流电泳仪和165-2029型垂直板电泳槽（BIO-RAD公司），匀浆器。

1.3 试剂 牛血清白蛋白，甘氨酸，Tris，十二烷基磺酸钠（SDS），N，N，N，N-四

甲基乙二胺（TEMED），丙烯酰胺（电泳级），甲叉双丙烯酰胺，均由北京拜尔迪生物公司提供，甲醇，乙酸，磷酸等有机试剂（北京化学试剂公司）。

2 实验方法

2.1 电泳样品的制备方法[4] 将采得的4种新鲜动物肉切碎，置于匀浆器中，加入5倍体积的1×电泳缓冲液（0.025mol·L-1 Tris，0.2 mol·L-1甘氨酸，3.5 mmol·L-1SDS）匀浆5分钟，再将4种匀浆液置于-80℃—常温反复冻融5次，3000rpm离心5min，取上清，与上样缓冲液混匀，沸水浴孵育3～5min，取出后冰浴，使蛋白质变性，离心5min，制得电泳样品。

2.2 样品液浓度的测定 采用Bradford方法测定样品的蛋白质浓度，见参考文献[5]。

2.3 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）[6] 本实验采用5%浓缩胶[6]，电泳初始电压为150V，染料进入分离胶后，增加到200V，染料到达分离胶底部约1cm处，停止电泳，取下凝胶，考马斯亮蓝R-250染色2h，脱色液（25%甲醇，7%乙酸）脱色至蛋白质区带清晰。

2.4 电泳图谱分析方法 采用凝胶定量软件Quantity One。

3 实验结果与电泳图分析结果

3.1实验结果 采用13%分离胶进行SDS-PAGE电泳，以等量60μg蛋白质上样，电泳图谱较清晰，蛋白质分离效果较好。4种动物肉的13%分离胶SDS-PAGE电泳图谱见图1

图1 四种动物肉的13%分离胶SDS-PAGE电泳图谱

Fig 1 SDS-PAGE （13% separating gel） of four animalsmeat

1-marker 2-鳄鱼肉（crocodile meat） 3-鱼肉（fish meat） 4-鸡肉（chicken meat） 5- 猪肉（ guinea pig meat）

3.2电泳图分析结果

电泳图谱分析采用凝胶定量软件Quantity One，使用该软件得到4种动物肉匀浆样品中主要蛋白质的分子量和其含量百分比，以及主要谱带的迁移率，按谱带的泳动快慢将电泳图谱分为A（Rf <0.35），B（0.350.65）3个区，并依各谱带着色程度将谱带分为三级[7]（见表1），色深而明显的为一级谱带，色浅但较明显的为二级谱带，色较浅仍可辨者为三级谱带。

结果分析表明，4种动物肉的谱带均有差异。鳄鱼肉在A区具有3条迁移率（Rf）分别为0.059、0.163、0.313的一级谱带，B区具1条Rf为0.425的一级谱带，；C区具3条一级谱带，Rf分别为0.672、0.727、0.985。

鳄鱼肉的特征性谱带为A3、A6、B3、C1、C4。这5条电泳条带与其他3种动物肉相应电泳条带的对比见表2

由表2可以看出，鳄鱼肉的A6、C1、C4条带是其特有的，其余3种动物肉均没有；鳄鱼肉A3条带含量比鸡肉高；鳄鱼肉的B3条带含量比鱼肉、鸡肉高。因此，鳄鱼肉的A3、A6、B3、C1、C4条带可以用来鉴别鳄鱼肉和其他动物肉。

由于鳄鱼肉具有5条非常明显的特征条带，故易于区别。以上动物肉均经3次重复试验，结果稳定一致，可作为鳄鱼肉与其他动物肉的鉴别依据。

4 讨论

由电泳图谱分析可知，暹罗鳄鱼肉在 A 区、C区分别有 2 条特征条带，在 B 区有 1 条特征条带。从条带的有无看，鳄鱼肉和鸡肉共有带为 A3，但在表达量上有所差别； 鳄鱼肉、鱼肉和鸡肉共有带为 B3，但在表达量上有较大差异；A6、C1和C4 为鳄鱼肉特有条带，其余3种动物肉中均没有，这5条带均可作为鳄鱼肉的特征鉴别带。由于鱼肉、鸡肉、猪肉所含蛋白成分与鳄鱼肉有所不同，临床疗效及保健功效也就有很大不同。本文通过用SDS-PAGE方法对4种动物肉进行差异蛋白的分析，认为可以用该方法作为鳄鱼肉保健品质量评价的依据。

参考文献：

[1] 许东晖，马海萍，梅雪婷等. 鳄鱼的活性物质及其药理作用、保健功效研究进展[J]. 中国海洋药物杂志，2007，26（6） ：44.

[2] 唐樑，秦明珠. 鳄鱼的药用研究和开发前景[J]. 中国医药指南，2007，5（11） ：346.

[3] 许东晖，罗肇璋，梅雪婷等. 鳄鱼止咳膏镇咳、祛痰、抗炎以及免疫调节作用研究[J]. 中国中药杂志，2007，32（10） ：961.

[4] 张贵君，李晓波，李仁伟等. T常用中药生物鉴定. 北京，化学工业出版社，2006. 67

[5] 杨桂兰，郭学平.Lowry 法和 Bradford 法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较.中国生化药物杂志，2003，24（3） ： 131

[6] 卢圣栋.现代分子生物学实验技术.北京： 中国协和医科大学出版社，1999. 382

[7] 金跃明.鹿鞭药材及伪品的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别研究.辽宁中医学院学报），2005，7（ 6） ： 623