血管紧张素II对骨髓间充质干细胞定向诱导为角质形成细胞调控作用的实验研究

2013-04-29 00:44徐媛刘宏伟程飚等
中国美容医学 2013年7期
关键词:骨髓间充质干细胞创面愈合

徐媛 刘宏伟 程飚等

[摘要]目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为角质形成细胞的可能性及在此过程中血管紧张素II(AngII)对其的调控作用。方法:抽取Wistar大鼠的骨髓,经全骨髓法分离、纯化MSCs,鉴定后建立MSCs细胞模型,用成胶质细胞诱导培养基诱导其为角质形成细胞,显微镜下观察其形态学变化。以添加了AngII的成角质形成细胞诱导培养基组与单纯成角质形成细胞诱导培养基组在诱导MSCs 7天、10天后行角蛋白10(CKP10) 免疫组织化学染色及流式细胞仪检测,并进行对比观察分析。结果:培养的MSCs具有成脂、成骨分化的能力。MSCs可以成功诱导为角质形成细胞,添加AngII的诱导组与对照诱导组CKP10免疫组化染色均有阳性表达,但添加AngII组阳性细胞数高于对照组。流式细胞仪检测显示CKP10阳性细胞百分率,AngII组为80.62%,对照组(32.46%),两者相差显著(P<0.05)。结论:MSCs可以诱导分化为角质形成细胞,ANGII对MSC的成角质形成细胞分化有显著的促进作用,这一作用可能是AngII促进创面愈合的机制之一。

[关键词]骨髓间充质干细胞;角质形成细胞;创面愈合

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2013)07-0739-04

众所周知,干细胞在创面修复中起到了重要的作用,其为创面愈合提供了各种组织细胞。业已证明,成体骨髓来源的间充质干细胞(MSCs) 具有多向分化潜能,可作为组织工程中多种种子细胞。关于MSCs分化为多种组织细胞的在体或离体实验研究,国内外已多见报道[1-6]。但MSCs体外培养分化为上皮细胞相关报道较少,其过程中各种调控因素尚不清楚。许多实验以及临床现象已经证明,肾素-血管紧张素系统(RAS)对促进创面愈合起了积极重要的作用。为了探讨MSCs是否能体外诱导分化为上皮细胞以及在这一过程中RAS所起的调控作用,笔者以Wistar大鼠为实验对象,体外培养其MSCs,观察 MSCs是否可分化为上皮细胞以及在这一过程中血管紧张素II(ANGII)所起到的调控作用。

1 材料和方法

1.1 MSCs的体外培养与鉴定:采用10~12周雄性Wistar大鼠(中山大学实验动物中心提供),大鼠颈椎脱臼处死,无菌条件下分离双下肢,低糖DMEM培养液从双侧胫骨及腓骨冲出骨髓,50目网筛虑过骨渣,离心弃上清液,以含体积分数10%的胎牛血清青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM/ F12培养液重悬沉淀,1×109/L密度接种,于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。24h首次半量换液,以后每3 天全量换液一次。按1∶3传代培养,接近融合的MSCs用质量浓度0.25%的胰蛋白酶(美国 Sigma公司)室温消化30s~1min。取第3代MSCs进行实验。取生长良好的第3代BMSCs,以2×104/ml的细胞密度接种于孔板中,分别加入成骨分化及脂向分化诱导液,观察诱导情况。用ALP染色及油红0染色鉴定MSCs多向分化能力。同时用流式细胞仪检测MSCs的CD29、CD45、CD71、CD90的阳性率。

1.2 成上皮诱导:取第3代MSCs按上诉浓度接种于孔板中,用成上皮诱导液进行培养,每3天全量换液一次。成上皮诱导液配置为含体积分数10%的胎牛血清青霉素(100U/ml) 和链霉素(100μg/ml)的DMEM/F12培养液中加入0.5nM骨形成蛋白-4(BMP-4) (R&D Systems),0.3mM抗坏血酸,3 ng/ml人表皮生长因子。于倒置显微镜下观察细胞形态的变化。

1.3 ANG II调控成上皮诱导:取第3代MSCs按上诉浓度接种于孔板中,分别设置对照组与实验组,对照组按上述成上皮诱导方案进行诱导,实验组在原有成上皮诱导液内加入1×10-7mol/L的ANG II。两组细胞均培养于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中,每3天全量换各自诱导液一次。

1.4 免疫细胞化学染色:分别在对照组与实验组细胞诱导7天及10天后,PBS洗去培养基,5%多聚甲醛固定,严格按照Maxim生物技术有限公司提供的免疫组化染色试剂盒说明书操作。氨基联苯胺(DAB)显色。角蛋白10(CKP10)多克隆抗体(Maxim)工作浓度1:100。苏木精复染.以非特异血清代替抗作为阴性对照。角蛋白阳性细胞胞浆呈棕黄色。

1.5 流式细胞仪检测:分别在对照组与实验组细胞诱导3天及7天后,PBS洗去培养基,0.25%的胰蛋白酶消化后收集细。CKP10多克隆抗体(Maxim)工作浓度l:20,4℃孵育30min。PBS洗涤3次,加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠二抗(Sigma)工作浓度l:200,4℃孵育30min。PBS洗涤3次后,流式细胞仪(BectonDickinson)检测。

2 结果

2.1 MSCs体外培养与鉴定:原代MSCs经24h体外培养,见少量贴壁细胞。贴壁细胞前2~3天生长缓慢,以后迅速增殖,呈克隆样生长,细胞呈较均一的梭形,7~10天汇合,细胞呈比较均一的梭形(图1)。BMSCs 经骨向诱导后第6天呈三角形或多角形。第8天,细胞外基质分泌增多,胞浆中及胞质外可见较多黑色颗粒,胞核色淡,胞浆色深。第21天,细胞聚集成多个散在结节,中心呈黑色致密团块状。钙钴法染色检测 ALP 活性呈阳性,胞浆内见深黑色颗粒(图2)。MSCs 经成脂诱导后第5天可见胞浆内黄色折旋旋光性小脂滴。随时间推移,小脂滴增多融合成大脂滴,细胞核被脂滴挤于一侧。10天油红0染色示脂滴呈红色(图3)。同时,第3代 BMSCs表面CD29、CD90检测阳性,CD45、CD71检测阴性(图4)。

2.2 MSCs诱导为上皮细胞已经ANGII在其中的调控作用:BMSCs经成上皮诱导后3天开始,部分细胞梭形形态发生变态,围绕细胞核成圆饼形,细胞质减少,细胞核所占细胞整体比例明显增大,细胞核有突起,呈典型上皮样细胞形态。诱导后7天时,两组细胞角蛋白10(CKP10)染色均成阳性,但实验组阳性细胞数明显多于对照组。诱导后10天CKP10染色,该现象更为明显(图5)。流式细胞仪检测,同等诱导时间下,实验组MSCs诱导为上皮细胞诱导率明显高于对照组(图6)。

3 讨论

创伤后,机体除调动创伤局部组织的细胞直接参与修复以恢复受损组织的完整性外,还通过动员骨髓来源的干细胞向受损组织迁移,其在创面分化为创伤修复所需细胞来促进创面愈合。MSCs来源于中胚层,具跨胚层分化潜能,Friedenstein等(1974)把骨髓来源的成纤维细胞移植到肾包膜下,可以诱导形成骨和骨髓;体内外许多实验表明MSCs有很大的可塑性,当把MSCs移植到非放射损伤宿主,MSCs可以分化为非造血组织细胞,包括肌肉、软 骨、骨、肝、心脏、脑、肠及肺等[7-9]。胚胎发育中存在一系列上皮-间充质转换,原始间充质细胞始于内细胞团,是首次上皮-间充质转换,形成新的组织器官需从间充质向上皮转换,反之亦然。关于MSCs诱导转化为上皮细胞的研究,国内外文献较少报道。木有已有的研究表明,支持MSCs能在特定条件下跨胚层诱导为上皮细胞,但诱导方案五花八门,诱导效能也各有高低[10]。在本试验中,笔者将BMP-4、抗坏血酸以及人表皮生长因子加入常规培养基中,成功将MSCs诱导为上皮细胞,诱导成功率高。这一现象,提示在创面愈合过程中,MSCs有可能可以向上皮细胞转化,为创面修复提供修复细胞,从而促进创面愈合。

虽然现有研究均指向MSCs能诱导分化为上皮细胞,但这一过程的调控因素及机制尚不明确。而由于MSCs的易获得性、多能性以及低免疫原性,奠定了其作为再生医学研究的重要靶细胞,并使人们看到了其临床应用的实际可能。因此,阐明MSCs向上皮细胞分化中的调控因素对于再生医学的临床转化有着重要的意义。

肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)是调节机体功能的重要激素系统之一。它不仅在调节血压以及水电解质平衡方面起到重要作用,而且还在心、脑、肺和血管等组织器官的损伤修复中扮演重要的角色。最近的研究发现:RAS在皮肤损伤修复与再生过程中也起到非常重要的作用[11-12],本实验亦证明了RAS在MSCs中的存在。而ANGII作为RAS中的重要活性物质,是否对MSCs诱导为上皮细胞这一过程进行干预,引起了笔者的关注。由本实验结果可以看出,添加ANGII组的上皮细胞转化率明显高于对照组,提高了诱导成功的可能性。一方面,机体内MSCs数量有限,若想获得足够数量的移植细胞,需经历较长的体外扩增阶段。如果在扩增阶段对MSCs给予相当的诱导,能在一定程度上消除细胞分化时的不稳定性,指引其像上皮细胞分化。另一方面,在提供创面床ANGII含量,有助于已经移行至创面的MSCs高效的分化为上皮细胞,积极的参与到创面修复中来促进创面愈合。

MSCs向上皮细胞分化是一个复杂的生物学过程,可能涉及多种信号通路的调控。通过上述实验结果,我们可以初步断定,ANGII对MSCs向上皮细胞转化有促进调节作用,而其调控实现机制有待于进一步的实验来证明。相信随着研究的进一步深入,MSCs转化为上皮细胞从而促进创面愈合这一过程将清晰的展示在我们面前,并将为火热的转化医学事业添砖加瓦。

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[11]刘宏伟,程飈,付小兵.局部组织肾素-血管紧张素系统在皮肤损伤修复和再生中的作用[J].中国病理生理学杂志,2011,27(1):191-195.

[收稿日期]2013-01-11 [修回日期]2013-03-22

编辑/张惠娟

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