葛根素—7—O—葡萄糖苷的氧化性作用研究

郭晶晶 丁选胜

【摘要】目的研究葛根素-7-O-葡萄糖苷的氧化性溶血作用。方法制备5%家兔红细胞悬液，与不同浓度供试药液共孵育，用AAPH诱导氧化溶血，检测药物的抗氧化性溶血作用。结果在低浓度范围（0.4～3mg/mL）内，药物显示出抗氧化性作用，而当浓度>3mg/mL后，药物的抗氧化性作用随浓度的增大而减小。结论临床使用该药时应控制在低浓度，增大浓度后药物的抗氧化性逐渐减弱。

【关键词】葛根素-7-O-葡萄糖苷；抗氧化；红细胞

【中图分类号】R961 【文献标识码】A【文章编号】1004-4949（2013）07-59-02

葛根为豆科植物野葛或甘葛藤的根，在我国药用历史悠久[1]，其中葛根素是葛根特有的也是主要的有效成分。1993年葛根素被卫生部批准用于临床。临床多使用葛根素注射液，用于心血管疾病的治疗。葛根素具有扩张冠状动脉，降血糖，降血脂，抗动脉粥样硬化，消除自由基和抗脂质过氧化等多种作用[2，3，4]。

葛根素化学名为4′，7-二羟基-8-β-D-葡萄糖基异黄酮，临床使用的葛根素多为注射剂，但是因葛根素水溶性差，临床需加入50%丙二醇助溶，高浓度的丙二醇易引起不良反应，因此，越来越多的研究专注于对葛根素进行结构修饰以改善其水溶性。葛根素糖基化修饰是一种有效的方法[5]，在7位加入一个葡萄糖基可以明显改善水溶性。报道指出葛根素-7-O-葡萄糖苷的水溶性较葛根素增加了18倍[5]。但是对于葛根素-7-O-葡萄糖苷的抗氧化性质未见报道。葛根素为异黄酮类物质，具有很好的抗氧化性质，这也是构成其药理作用的基础之一。因此本文着重研究葛根素-7-O-葡萄糖苷的抗氧化作用。

本实验中使用红细胞的体外氧化溶血模型，因为红细胞膜富含不饱和脂肪酸，易受自由基的氧化攻击，最终导致红细胞溶血[6，7]。实验采用水溶性自由基产生体系2，2-偶氮（2-甲基丙基脒）二盐酸盐（AAPH）诱导氧化性溶血。AAPH是常用的氧化物质，因为其性质稳定，水溶性好[8]。

1材料

1.1受试药物：葛根-7-O-葡萄糖苷单体，南京师范大学袁生教授提供，纯度98%。

1.2实验动物： 家兔6只，体重1.8-2.2kg，雌雄各半，南京青龙山动物繁殖所提供，生产许可证号：SCXK（苏）2012-0008。

1.3试剂及仪器：

氯化钠注射液，购自江苏亚邦生缘药业有限公司，批号：12051203；蒸馏水；2，2-偶氮（2-甲基丙基脒）二盐酸盐（AAPH），购自上海百灵威科技有限公司，CAS号：2997-92-4。80-2离心沉淀剂，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；HH-S型恒温水浴锅，巩义市英峪予华仪器厂；752N紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；BS124S分析天平，Sartorius。

2方法

2.1 50mg/mL葛根素-7-O-葡萄糖苷溶液的配制： 精密称取药物1.25g置于25mL容量瓶中，用氯化钠注射液定容。

2.2 5%家兔红细胞悬液的配制： 取兔血10mL，玻璃棒搅动去纤维。将血液于离心机中1500r/min离心15分钟，除去上层血浆。沉淀的红细胞再用氯化钠注射液洗涤2-3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用氯化钠注射液配成5%的红细胞悬液。

2.3 AAPH诱导氧化性溶血实验 ： 取洁净试管11支，编号1～11号，其中1～9号试管为不同浓度药液管，10号、11号分别为阴阳性管，按表1进行加样，并向供试管各加入250mmol/L的AAPH溶液1.40mL，使供试管药物的终浓度分别为0.4、0.8、1.2、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mg/mL，同时所有供试管AAPH的终浓度都为70mmol/L，所有试管于37℃水浴孵育3h。孵育完成后，1500r/min离心15min，吸取上清液于紫外可见分光光度计540nm处测定吸光度（A值）。按下式计算各管溶血率：溶血率（%）=[（样品管A值-空白对照管A值）/（阳性对照管A值-空白对照管A值）]×100%。计算平均溶血率，结果见图1。

3结果

实验结果表明，AAPH可以诱导红细胞的氧化损伤，使红细胞膜破裂而产生溶血。从图1可以看出，在低剂量范围内（0.4～3mg/mL），随着药物浓度的增加，溶血率逐渐减小。在高剂量范围内（3～12mg/mL），溶血率随药物浓度的增加而逐渐增大。

图1AAPH诱导红细胞氧化性溶血曲线

4讨论

本实验中产用了AAPH氧化体系来研究葛根素-7-O-葡萄糖苷的抗氧化性质。红细胞膜富含多不饱和脂肪酸，对氧化损伤敏感，是研究氧化损伤作用的良好模型。AAPH属于水溶性偶氮引发剂，通过均裂产生阳离子自由基，该自由基与O2快速反应生成过氧化自由基，进而氧化损伤红细胞膜导致溶血。实验结果表明，在低浓度范围内（0.4～3mg/mL），药物呈现出很好的剂量依赖性的抗氧化作用。当药物浓度超过3mg/mL，其抗AAPH氧化损伤的能力随着浓度的增大而减弱，甚至表现出一定的致溶血作用。提示临床在使用葛根素-7-O-葡萄糖苷时应控制在低剂量范围，因为高剂量下药物的抗氧化性减弱。

参考文献

[1]罗琼，郝近大，杨华等.葛根的本草考证[J].中国中药杂志，2007，32（12）：1141-1144.

[2]亢小迪.葛根素治疗不稳定型心绞痛的疗效及发热不良反应防治[J].时珍国医国药 2008， 19（6）：1469-1470.

[3]谢瑞芹，都军，郝玉明等. 葛根素注射液对冠心病患者缺血再灌注心肌保护作用及机制[J]. 中国中西医结合杂志 2003，23（12）：895-897.

[4]Xuan Bo， Zhou Yue-hua， Yang Rua-lin， et al. Improvement of ocular blood flow and retinal functions with puerarin analogs[J]. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics 1999，15（3）： 207-216.

[5]Jiang Jie-rong， Sheng Yuan， Ding Juan-fang， et al. Conversion of puerarin into its 7-O-glycoside derivatives by Microbacterium oxydans （CGMCC 1788） to improve its water solubility and pharmacokinetic properties[J]. Applied Microbiology and Biotechnology 2008， 81：647-657.

[6]Arnab Banerjee， A. Kunwar， B. Mishra， et al. Concentration dependent antioxidant/pro-oxidant activity of curcumin. Studies from AAPH induced hemolyssi of RBCs[J]. Chemico-Biological Interactions 2008， 174：134-139.

[7]Ana S. Magalhaes， Branca M. Silva， Jose A. Peraira， et al. Protective effect of quince（Cydonia oblonga Miller） fruit against oxidative hemolysis of human erythrocytes[J]. Food and chemical Toxicology 2009， 47：1372-1377.

[8]C.S. Shiva Shankar Reddy， M.V.V. Subramanyam， R.Vani， et al. In vito models of oxidative stress in rat erythrocytes： Effect of antioxidant supplements[J]. Toxicology in vitro 2007， 21：1355-1364.