cyclin D3调控LN308胶质瘤细胞迁移研究

章倩倩??周惠??屈良鹄??王丽京

[摘要] 目的 探讨细胞周期蛋白D3（CCND3）在LN308胶质瘤细胞中的作用。 方法 根据NCBI GenBank中cyclin D3序列设计双链siRNA，利用western blotting技术验证设计的siRNA序列的有效性，并通过流式细胞术检测抑制CCND3对LN308胶质瘤细胞周期进程的影响；通过transwell检测CCND3对LN308细胞迁移的影响。 结果 经western blotting检测，成功抑制了CCND3的表达。并且发现与对照组相比较，抑制CCND3表达对LN308细胞周期无影响，但是可以显著抑制LN308细胞的迁移。 结论 LN308细胞中CCND3并不发挥调控细胞周期的功能，而是影响细胞的迁移，促进肿瘤的发展。本研究为临床上靶向治疗胶质瘤提供了理论基础。

[关键词] cyclin D3；胶质瘤；细胞迁移

[中图分类号] R739.41 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）08-31-03

神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，发病率约占成人颅内肿瘤的40%～50%，并且其通过手术及放化疗治疗预后极差[1-2]。大量研究证实胶质瘤中存在cyclin D1和cyclin D3过表达，并且其表达程度与肿瘤恶性程度和患者预后相关[3-9]。然而，cyclin D3在胶质瘤中所发挥的作用报道较少。因此，确定cyclin D3对胶质瘤发生、发展的调控机制，有助于进一步研究以cyclin D3为靶点的药物对胶质瘤进行治疗。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人类神经胶质瘤细胞株LN308培养于含10%胎牛血清及添加100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基。并置于5% CO2培养箱中37℃培养至80%～90%融合后传代培养，取处于指数生长期的细胞进行试验。

1.2 试剂和仪器

DMEM高糖培养基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司）；cyclin D3 siRNA（上海吉玛公司）；CCND3一抗（CST，美国）；Nocodazole（Sigma公司）；Transwell小室（Corning，美国）。CO2培养箱（Thermo，美国）；倒置显微镜（Olympus，日本）。

1.3 方法

1.3.1 细胞分组及转染处理 取指数生长期细胞于6孔细胞培养板每个孔接种3×105个细胞。分为正常生长组、空白对照组（NC）、siRNA组。24 h以后对细胞进行转染，具体实验方案参考LipofectaminTM 2000产品使用说明书。细胞接种24 h后吸取培养基，加入无血清无双抗的DMEM培养基2 mL。准备转染复合物，溶液A：250μL Opti-MEM培养基+5 μL LipofectaminTM2000，溶液B：250μL Opti-MEM培养基+50μM siRNA，室温下分别静置5 min。然后将溶液A与溶液B混合，室温静置20 min后加入细胞中。放入CO2培养箱静置培养，6 h后换成含血清和双抗的DMEM培养基。

1.3.2 蛋白免疫印迹 转染siRNA后48 h的细胞用RIPA裂解蛋白，BCA法检测蛋白浓度。每组取60μg总蛋白跑SDS-PAGE，250 v转PVDF膜后5%脱脂奶粉室温封闭1 h，4℃一抗封闭过夜，然后将HRP标记二抗室温孵育1 h，ECL法发光，暗室曝光、显影、洗片。

1.3.3 流式细胞术检测细胞周期 在转染siRNA后24 h的细胞中加入100 ng/mL Nocodazol将细胞周期同步化；继续培养20 h，收集细胞培养液及细胞，离心收集细胞，加入冰冷的NP40/PI染液及25 mg/mL RNase A，37℃水浴30 min；通过300目筛网过滤入流式管中，上机检测。

1.3.4 Transwell检测细胞迁移 细胞转染50 nM NC或者siRNA同时将transwell小室放入无血清，无双抗的DMEM培养基中水化。转染后细胞继续培养24 h，收集细胞并计数，在transwell小室上室中加入4×104个细胞，继续培养20 h，然后用1%结晶紫染色小室下方转移过去的细胞，并擦除上室中未转移的细胞，显微镜下观察拍照。

1.4 统计学处理

细胞周期分布用Modfit3.0软件（Verity Software House，Topsham，ME，USA）分析。实验采用3次独立实验结果数据进行统计，所得数据用统计软件SPSS17.0进行分析，数据均以（）表示，在进行两组之间的差异分析时选用双尾Students t-test，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 验证设计的siRNA序列的有效性

参照NCBI GenBank中人类CCND3 cDNA序列设计siRNA序列5'-GAUGCUGGCUUACUGGAUGdTdT-3'，对LN308细胞进行转染，收取蛋白进行免疫印迹检测。如图1所示，设计的siRNA可以有效抑制CCND3的表达。

图1 western blotting检测siRNA抑制CCND3表达

2.2 CCND3对LN308细胞周期的影响

转染后细胞加入100 ng/mL Nocodazole使细胞周期同步在G2期，检测CCND3对LN308细胞周期的影响。如图2所示，CCND3虽然为细胞周期蛋白，但是其在LN308细胞中对细胞周期并不发挥调控作用。

图2 抑制cyclin D3表达对LN308细胞周期影响

2.3 CCND3对LN308细胞迁移的影响

LN308细胞中抑制CCND3表达后，通过Transwell实验检测LN308细胞迁移率的变化。如图3A所示，发现CCND3下调后迁移至小室下方的LN308细胞数量显著降低。并且通过统计发现，抑制CCND3的表达，LN308细胞迁移到下室的细胞数量减少了近60%（图3B）。

图3 抑制cyclin D3表达对LN308细胞迁移影响

A：Transwell检测抑制CCND3表达对细胞迁移的影响（20×）；B：随机取5个视野，对阴性对照组及CCND3 siRNA组细胞迁移的数目进行统计

3 讨论

近年来的分子生物学研究表明，细胞周期蛋白D家族（cyclin D）包括cyclin D1、cyclin D2和cyclin D3三种亚型，并且cyclin D家族成员在许多肿瘤中均表达上调[10]。虽然3种cyclin D家族成员在氨基酸序列上具有高度同源性，但是它们在组织和细胞中却存在表达差异。在人脑胶质瘤组织中，cyclin D1在胶质瘤组织中的表达显著高于正常脑组织，而cyclin D3仅在恶性程度较高的肿瘤组织中表达显著上调[3-5]。表明cyclin D3与胶质瘤的发展具有相关性，但是其在胶质瘤中的作用到底如何有待进一步探讨。

对于cyclin D1在肿瘤中的功能研究已有大量报道[11-13]，近年来对于cyclin D3失调在肿瘤发病过程中的作用越来越受到重视，成为肿瘤发病机理研究的热点。本研究明确指出，cyclin D3作为细胞周期蛋白家族的一员，在LN308胶质瘤细胞中并不对细胞周期进程进行调控。对cyclin D3的研究发现，其与肿瘤的发生相关，而且与肿瘤的转移、预后也密切相关[14-16]。高表达cyclin D3患者通常表现出临床症状较重，发生转移的概率更高，对传统化疗的敏感性差，生存率低。由于临床相关性检测发现cyclin D3仅在高度恶性的胶质瘤组织中高表达[3-5]，因此我们推测其可能调控胶质瘤细胞的侵袭。通过本研究结果分析，发现cyclin D3在恶性胶质瘤细胞中能够调节细胞的迁移，说明cyclin D3虽然作为细胞周期蛋白家族成员，在胶质瘤中仅调控肿瘤细胞的迁移而促进肿瘤的发展。

胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，胶质瘤细胞生长速度较快，并且常沿着周围组织和神经纤维浸润性生长[1-2]。目前对于胶质瘤的治疗方法为外科手术以及放、化疗治疗，但是难以将其彻底根除。因此，如何有效的治疗胶质瘤及改善预后成为目前临床关注的一个焦点。基因治疗是目前治疗肿瘤的最新治疗方法，基于cyclin D3表达异常在胶质瘤的发展中扮演着重要角色，利用反义cyclin D3对靶细胞进行基因治疗将为胶质瘤的治疗提供新途径。

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（收稿日期：2013-04-11）