不同因素与痰涂片抗酸杆菌检出关系探讨

梁海燕，黄艺，米利古，李永祥，袁俐

（石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子 832000）

结核病是我国重点控制的传染病之一，新疆是我国结核病高发地区，结核病疫情不容忽视。简单、适宜诊断方法的应用对于有效防控本地区结核病的严峻疫情至关重要。迄今为止，特别是在资源有限的发展中国家，痰涂片萋－尼抗酸染色法查找抗酸杆菌仍然是临床上结核病诊断与鉴别诊断的金标准之一，也是评估治疗效果、考核疗效的可靠指标之一。世界卫生组织多次强调涂片镜检要注重采痰质量［1］，因此提高结核病实验室痰检质量，以及肺结核病人涂阳发现率，已成为当前结核病控制规划实施中的重要内容。涂片镜检一方面受痰检人员检查水平的影响，另外合格的痰样本也非常重要。在前期研究中，文献［2－7］已提出某些注意事项（特别是在疑似肺结核的女性中）对于提高涂痰阳性率有重要影响，但这些因素的影响权重并未见报道。本研究的目的是阐明疑似肺结核患者痰标本的性状、痰量以及患者性别与痰涂片阳性的统计学关系。

1 材料与方法

1.1 标本采集

1.1.1 痰液的收集

收集2010年11月～2012年6月新疆南、北疆主要地区疑似活动性肺结核而去当地医院就诊患者的痰液，按照《中国结核病防治规划实施工作指南》（以下简称“指南”）中要求，每位就诊患者总共提交三份痰标本，包括即时痰、夜间痰及清晨痰各一份。在提交之前，告知患者有关提交合格痰标本的细节，包括痰质量的重要性，以及如何正确咳痰。但是，我们并未提及痰量。排除以往有结核病治疗史，或在过去60天里接受过抗结核治疗，所有的参与者获得书面知情同意书。

1.1.2 痰标本性状

痰标本性状按《指南》要求分为：唾液、黏液痰、干酪痰和血痰痰量以毫升为单位，参照参考容器测量样本容器中的痰量。

1.1.3 人口统计学资料和临床特征的采集

采用问卷调查收集人口统计学资料和临床特点，问卷内容包括人口统计学信息（年龄、性别、吸烟史）以及临床特征（呼吸系统症状，如咳嗽，咳痰，咯血，以及全身症状，包括发热，盗汗，体重减轻等）。

1.2 试剂与仪器

玻片，购自石河子北生物商贸有限公司，玻片正面有固定大小椭圆形胶圈。萋－尼抗酸染色所需试剂（石碳酸复红染色液、5%盐酸乙醇脱色液、亚甲蓝复染液）均由珠海贝索生物技术有限公司生产，所有试剂均在有效期内。CLASSⅡTYPE A2生物安全柜，由北京东联哈尔仪器制造有限公司出品。

1.3 实验方法

1.3.1 痰标本直接涂片法

按照《指南》实施，但涂片时注意用铂丝环尽量挑取痰标本中的干酪样或血性部分。

1.3.2 萋－尼抗酸染色

同样按照《指南》实施，但染色时注意：①加热时不能使染液沸腾；②脱色时间不宜太长，以免抗酸杆菌也被脱色而不好辨认；③冲洗时所用水流要缓，还应避免直接冲洗痰膜。

1.3.3 涂片镜检

用光学显微镜（目镜10×，油镜100×）进行观察，结果记录在结核病细菌学实验登记本上。

1.3.4 痰样本量的记录

以毫升为单位，参照参考容器测量记录样本容器中的痰量。

1.3.5 统计分析

采用SPSS13.0软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 不同性状痰标本在不同性别间的分布

2010年11月～2012年6月新疆南北疆主要地区共采集痰液2018份，其中唾液样痰444份、黏液痰853份、干酪痰672份、血痰49份，共检出阳性痰标本470份，检出总阳性率为23.3%（470／2018）。

结果见表1。

唾液检出阳性率5.6%（25／444），占检出阳性痰标本5.3%（25／470）；黏液痰检出阳性率16.1%（138／853），占检出阳性痰标本29.4%（138／470）；干酪痰检出阳性率42.1%（283／672），占检出阳性痰标本60.0%（283／470）；血痰检出阳性率51.0%（25／49），占检出阳性痰标本5.3%（25／470）。痰标本涂片阳性检出率在不同性状的痰标本之间分布有差异（男性 χ2＝167.121，P＜0.05；女性 χ2＝88.838，P＜0.05）。干酪痰和血痰的阳性检出率相对较高。

表1 不同性状痰标本在不同性别的阳性检出结果Tab.1 The positive results of sputum specimens of different traits in different sexes

2.2 不同咳痰时间的痰标本在不同性别痰涂片阳性率的检出

在所收集的2018份痰标本中，清晨痰标本706份，其中涂阳数209份，涂阳率29.6%（209／706）；夜间痰标本587份，其中涂阳数108份，涂阳率18.4%（108／587）；即时痰标本725份，其中涂阳数153份，涂阳率21.1%（153／725）。不同咳痰时间的痰标本在不同性别间的分布有差异（男性χ2＝16.346，P＜0.05；女性χ2＝9.536，P＜0.05），分布率见表2。其中以清晨痰阳性检出率最高。

表2 不同咳痰时间痰标本在不同性别的阳性检出结果Tab.2 The positive results of expectorating in different time in different sexes

2.3 不同体积的痰标本在不同性别涂片阳性率的检出

在所收集的2018份痰标本中，体积＜1mL的痰标本335份，其中涂阳数41份；体积在1～2mL之间（包括1mL）的痰标本数267份，其中涂阳数42份；体积在2～3mL之间（包括2mL）的痰标本数354份，其中涂阳数86份；体积在3～4mL之间（包括3mL）的痰标本数498份，其中涂阳数124份；体积在4～5mL（包括4mL）的痰标本数456份，其中涂阳数145份；体积≥5mL痰标本数108份，其中涂阳数32份。不同体积的痰标本在不同性别间的分布（表3）。

表3 不同体积痰标本在不同性别的阳性检出结果Tab.3 The positive results of sputum specimens of different volume in different sexes

痰标本涂片阳性检出率在不同体积的痰标本之间分布仅在女性有差异，在男性无差异。痰量（≥3 mL与≥4mL）在女患者中与痰涂片阳性相关，但是在男性患者中两者无关（表4）。

表4 不同体积痰标本在不同性别间的分布差异Tab.4 The distribution of sputum specimens of different volume in different sexes

3 讨论

结核病是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。我国结核杆菌感染率为44.5%，结核病的患病年青化、以青壮年为主。结核病与艾滋病等疾病伴发以及多药耐药等现象致使我国结核病的防控形势严峻。新疆活动性肺结核病患病率、涂阳患病率和死亡率分别是464／10万，160／10万和38／10万，分别是全国平均水平的1.26倍，1.51倍和3.88倍；少数民族活动性肺结核、涂阳肺结核、菌阳肺结核患病率分别是同地区汉族人的12.4倍、16.9倍和18.4倍。结核病的细菌学涂片检查仍然是发现传染源的主要方法之一，特别是在资源有限的发展中国家，是临床上诊断与鉴别诊断肺结核的金标准之一，由于其具有简便、快捷、廉价等诸多优点，尤其适用于基层，特别是在新疆这样的边远地区。因此，提高新发结核病例痰标本的阳性检出率，具有很大意义。

本研究结果显示：肺结核女病人痰的性状、不同咳痰时间以及痰液量都与痰涂片阳性率有关，男性结核病患者，只有前两者与痰涂片阳性相关。采集疑似感染结核杆菌的痰标本中，外观为干酪痰或血痰的标本增加了阳性的可能性。另外，那些外观看来质量不好的样本可能会被低估而降低痰涂片阳性率，本研究证实了痰液性状对痰涂片阳性率的影响，这与其他研究者报道的结果相似［2，8－9］，但是像口水一样的痰标本仍不能丢弃，因为它们也可含结核杆菌［10－12］。在本研究中，口水中抗酸杆菌的阳性率并不低（5.6%，25／444）。另外，本研究发现咳痰时间对涂片阳性率的检出也有影响。其中以清晨痰的阳性检出率最高，其次是即时痰和夜间痰。以上与宋凯［13］等的结论一致，这可能是因为病人夜间咳痰次数少，细菌排出量相对也较少，故次日清晨所咳痰中含有菌量密度相对增高，致痰检阳性率提高。故应特别注意清晨痰的送检。

痰量（≥3mL）在女患者与痰涂片阳性有关，但是在男性患者中无关。以上可能是由于女性患者比男性更不精通咳痰［3－14］，在试图咳痰的时候，随着必需痰量的增加，女性咳出适量痰液的机会也随之增加。相反，不管所需痰量为多少，男性咳出适量痰的机会相对较稳定，因为他们更容易咳出适量的痰。痰涂片阳性在男性与痰量无关，而在女性，随着痰量增加这种趋势也增加，这更加证实了这种可能性。事实上，本研究结果与 Khan MS［3］报等道一致，即对女性而言，如果增加痰液的量，痰涂片阳性率将明显提高。如果可能的话，对那些不能提供适量痰标本的病人，痰引流或支气管镜检查可以被用作评估痰涂片阳性的一种技术［4］。这与 Yoon SH 等［15］的研究结果不太一致，因为Yoon SH的研究中提到女性患者痰量（≥4mL）才与痰涂片阳性有关，至于其原因有待进一步探讨。

对于那些疑似结核病的患者，虽然已经有研究证实疑似结核病患者做痰检所需痰液的最小有效体积，但是具体多少量是最理想的目前尚没有达成共识。2、3、5mL的痰液均被推鉴［17］，但也没有详细的分析。为了确定最合适的最小痰液体积，我们实验了各种浓度（1、2、3、4、5mL），对于女性疑似患者，3mL是最理想的最小痰液体积。

4 结论

痰样本性状、咳痰时间和痰液体积与痰涂片阳性相关。在女性疑似结核患者，3mL痰液是痰涂片显微镜检查可接受的最理想的最低痰液体积。我们应该鼓励疑似结核患者尽力提交合格的痰样本，以提高痰涂阳检出率，为更好地控制结核蔓延做基础。

［1］API Consensus Expert Committee.API TB Consensus Guicle lines 2006：Manage ment of pulmonary tuberculersis，extra pumonary tuberculersis and tuberculersis in special situations［J］.J Assoc physicians India，2006，54：219－234.

［2］Alisjahbana B，van Crevel R，Danusantoso H，et al.Better patient instruction for sputum sampling can improve microscopic tuberculosis diagnosis［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2005，9（7）：814－817.

［3］Khan M S，Dar O，Sismanidis C，et al.Improvement of tuberculosis case detection and reduction of discrepancies between men and women by simple sputum－submission instructions：apragmatic randomised controlled trial［J］.Lancet，2007，369（9577）：1955－1960.

［4］Warren J R，Bhattacharya M，De Almeida K N，et al.A minimum 5.0ml of sputum improves the sensitivity of acid－fast smear for Mycobacterium tuberculosis［J］.Am J Respir Crit Care Med，2000，161（5）：1559－1562.

［5］Hirooka T，Higuchi T，Tanaka N，et al.The value of proper sputum collection instruction in detection of acidfast bacillus［J］.Kekkaku，2004，79（2）：33－37.

［6］ Macq J，Solis A，Velazquez H，et al.Informing the TB suspect for sputum sample collection and communicating laboratory results in Nicaragua：a neglected process in tuberculosis case finding［J］.Salud Publica Mex，2005，47（4）：303－307.

［7］Sakundarno M，Nurjazuli N，Jati S P，et al.Insufficient quality of sputum submitted for tuberculosis diagnosis and associated factors，in Klaten district，Indonesia［J］.BMC Pulm Med，2009，9：16.

［8］Ramsay A，Bonnet M，Gagnidze L，et al.Sputum，sex and scanty smears：new case definition may reduce sex disparities in smear－positive tuberculosis［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2009，13（5）：613－619.

［9］Bonnet M，Ramsay A，Githui W，et al.Bleach sedimentation：an opportunity to optimize smear microscopy for tuberculosis diagnosis in settings of high prevalence of HIV［J］.Clin Infect Dis，2008，46（11）：1710－1716.

［10］Curione C J，Voss J L，Hesse F，et al.Gram stain evaluation of the quality of sputum specimens for mycobacterial culture［J］.J Clin Microbiol，1977，5（3）：381－382.

［11］Isaac－Renton J L，Puselja B B，Allen E A，et al.Microscopic evaluation of sputum specimens submitted for Mycobacterium tuberculosis culture［J］.Am J Clin Pathol，1985，84（3）：361－363.

［12］Murray P，Baron E J，Jorgenson J H，et al.Manual of Clinical Microbiology.9th edition［M］.Washington.DC：ASM Press，2007：1－319.

［13］宋凯.咳痰时间、痰标本性状与涂片抗酸杆菌检出关系分析［J］.中国防痨杂志，2008，30（5）：414－416.

［14］Alisjahbana B，van Crevel R.Improved diagnosis of tuberculosis by better sputum quality［J］.Lancet，2007，369（9577）：1908－1909.

［15］Yoon S H，Lee N K，Yim J J.Impact of sputum gross appearance and volume on smear positivity of pulmonary tuberculosis：aprospective cohort study［J］.BMC Infectious Diseases，2012，12（1）：172.