葡萄糖氧化酶活性变化的分析

周生民，赵 伟

（山东福洋生物科技有限公司，山东 德州 253100）

葡萄糖酸钠是一种多羟基羧酸钠，白色结晶颗粒或粉末，极易溶于水，微溶于酒精，不溶于乙醚，又被称为五羟基已酸钠，分子式为C6H11O7Na，分子质量为218.14，含量大都在98%以上。目前，葡萄糖酸钠生产普遍采用黑曲霉发酵法生产。据统计黑曲霉发酵中产生的酶有过氧化氢酶、纤维素酶、半乳糖酶、葡萄糖氧化酶等20多种酶[1-2]。其中，葡萄糖氧化酶在葡萄糖氧化反应中起主导作用。因此，对葡萄糖氧化酶的研究直接影响葡萄糖酸钠的生产。

葡萄糖氧化酶系统称为β-D-葡萄糖氧化还原酶（glucose oxidase，GOD），是一种淡黄色透明液体酶制剂，能催化葡萄糖氧化成葡糖酸并产生过氧化氢的酶。该酶含有两分子黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）的黄素蛋白，图1为葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖为葡萄糖酸的反应机理[3-4]。

葡萄糖氧化酶的pH稳定范围较宽，在pH4～8范围内较稳定。酶蛋白在pH5.0～5.5范围酶活基本不变，在pH6～8范围内也较稳定，酶活力均保持在72%以上。葡萄糖氧化酶蛋白在20℃～50℃范围内热稳定性很好，30℃时酶活力比原酶活力可上升16%，60℃时酶活力下降至51%，70℃时下降更为显著[5]。葡萄糖是该酶的稳定剂，一般来说，酶反应受底物浓度的影响不大，葡萄糖浓度为5%～20%，反应速度几乎不变[6]。

葡萄糖酸钠具有非常广泛的用途，在建筑业中被广泛用作水泥缓凝剂，可以防止混凝土在运输的过程中凝固和结块现象，另外还可被用作钢铁表面清洗剂、阻垢缓蚀剂。食品级和医药级产品，可以调节人体的酸碱平衡，有效防止低钠综合症的发生，用作食品添加剂和医药中间体等。

图1 葡萄糖氧化酶氧化机理Fig.1 Oxidation mechanism of glucose oxidase

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑曲霉（Aspergillus niger）：福洋生物科技有限公司保藏菌种。

1.2 仪器与设备

小型在线检测发酵罐：国强生化有限公司；722紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；电炉：武汉嘉华炉业有限公司；MAX300LG质谱仪：杭州瑞析科技有限公司；XSPBM-2CBAC显微镜：西派克光学仪器有限公司；HA-HH-4恒温水浴锅：环宇科学仪器厂。

1.3 方法

葡萄糖氧化酶酶活定义：在pH5.6，温度为30℃条件下，每分钟催化1μmol葡萄糖转化为葡萄糖酸和过氧化氢所需的葡萄糖氧化酶的量为一个酶活力单位（U）。

根据酶的pH稳定性和底物浓度稳定性，选择发酵液pH5.2左右和糖浓度19%时取发酵液过滤处理，在酶活相对稳定的环境下测定此时酶活并记录。取4支离心管分别标号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，将过滤后的发酵液分别装入4支离心管，将Ⅰ号离心管存放在4℃冰箱内，将Ⅱ号离心管常温25℃保存，Ⅲ号离心管放入37℃恒温箱保存，Ⅳ号离心管放入70℃恒温箱保存，每1h检测1次酶活并记录。

酶活检测：分别添加2.4mL用无水乙酸钠稀释的邻联茴香胺、0.5mL 10%葡萄糖溶液、0.1mL辣根过氧化氢酶溶液于35℃水浴锅提前预热5min。检测时向混合溶液中添加0.1mL过滤后的发酵液，于波长500nm处每30s记录吸光度值（A500nm），每30s记录一次，以A500nm对时间作图，找出最大斜率△A/min。酶活计算公式如下：

注：7.5为氧化型邻联茴香胺的消光系数。

测定过程中维持发酵液葡萄糖氧化酶活性测定结果在1000U/mL左右为宜，活性过高则应稀释，不得超过5000U/mL。

2 结果与分析

根据葡萄糖氧化酶pH稳定性和底物浓度稳定性，对所取样品进行检测，测得的pH值为5.3，葡萄糖浓度为18%，都处于葡萄糖氧化酶活力稳定范围[7]。每1h对所取的3个处于不同温度的样品进行酶活性检测。

图2 不同温度下酶活随时间的变化趋势Fig.2 Change of enzyme activity at different temperatures

从图2可以看出，保存于4℃的样品不同时间所测得的酶活性基本接近于初始值，保存于25℃、37℃和70℃的样品都偏离初始值，25℃时所测得的酶活性呈上升趋势，比初始值有所上升，而37℃和70℃时所测得的酶活性有下降趋势，并且温度处在70℃时酶活性下降最明显。

从图2还可以看出，葡萄糖氧化酶活性范围比较宽，从4℃～70℃葡萄糖氧化酶都存在活性，4℃和25℃葡萄糖氧化酶的稳定性都比较好，而25℃更接近于真实值，37℃和70℃葡萄糖氧化酶波动较大不能真实反映酶的活性，从酶的动力学方面看，可能是温度对酶的活性基团有一定的影响，才改变了不同温度下酶的活性[7-9]。

3 结论

在产葡萄糖酸钠的黑曲霉发酵过程中，氧化葡萄糖形成葡萄糖酸钠的酶是葡萄糖氧化酶，其活性决定了耗糖速率大小和产酸的快慢，所以研究酶活性的变化趋势相当重要[10-11]。发酵液中酶活性在取样之后立刻检测才能较真实反映酶的活性，从图2中可以看出，酶在4℃时酶活性基本保持与初始值相似基本反映发酵过程中酶活力的大小。而25℃、37℃和70℃时酶活性都偏离了初始值，也就都偏离了发酵罐中酶的真实活性[12-13]。

葡萄糖酸钠发酵是一个复杂的生物发酵过程，其中存在各种酶参与的各种复杂的生物化学反应，只有了解了酶活的变化趋势才能更好的控制生产工艺，才能使发酵过程中的酶达到最高效的催化氧化的效果，产品的质量和产量才能进一步得到提高[14-15]。

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