同型半胱氨酸及其代谢酶亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性在傣族高血压及正常人群的分布研究

2013-04-20 06:27蕾,孙
中国全科医学 2013年27期
关键词:傣族条带等位基因

张 蕾,孙 浩

高血压在我国已经成为严重威胁人们健康的主要疾病,亦是导致脑血管疾病的重要危险因素。近年研究表明,同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平升高可以造成血管内皮损伤、血管平滑肌增生,并抑制一氧化氮(NO)合酶和前列环素 (PGI2)的合成,这些损害目前被认为与高血压的发病有关。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)对Hcy水平有重要影响,其基因C677T突变可影响该酶的活性,使Hcy代谢异常。但MTHFR基因C677T多态性与Hcy水平改变对高血压发病的影响国外报道不一,国内报道亦未涉及少数民族人群。本研究对傣族高血压患者及健康者血清Hcy水平与MTHFR基因C677T多态性进行检测,以探讨MTHFR基因C677T多态性、Hcy水平改变与傣族人群高血压发病的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2011年3月在西双版纳傣族自治州进行疾病普查时选取傣族高血压患者133例,其中男76例,女57例;年龄29~81岁,平均60.5岁。不同时间在静息状态下测量血压,3次均≥140/90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)(分次测量血压的时间间隔不小于5 min)为高血压。傣族健康者134例,其中男71例,女63例;年龄23~79岁,平均58.5岁。排除患有冠心病、周围血管病、血液系统疾病、肝肾功能异常、甲状腺疾病、严重感染、恶性肿瘤、糖尿病、慢性胃肠道疾病、妊娠,近2周内服用过甲氨蝶呤、NO、避孕药、抗癫痫药、叶酸、B族维生素、雌激素、异烟肼、酰胺咪嗪、烟酸、肼苯哒嗪者。

1.2 MTHFR分型方法 以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测MTHFR基因C677T(rs1801133)突变情况。取250 μl外周血,使用AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒(AxyGen中国)提取白细胞中的DNA。使用引物F:5′-GGAAGGTGCAAGATCAGAGC-3′和R:5′-CTGGGAAGAACTCAGCGAAC-3′对rs1801133进行扩增。扩增条件为(PCR试剂来自TaKaRa公司):DNA样本20 ng,MgCl2(25 mmol/L):1.2 μl;dNTP(2.5 mmol/L):1.6 μl;正反向引物(5 μmol/L)各1 μl;Taq酶(55 U/μl):0.16 μl;10×PCR Buffer:2.5 μl;加水至总体积20 μl。扩增条件为:94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,至第一步重复30个循环,72 ℃ 10 min。

取PCR产物5 μl,酶切缓冲液2 μl,Hinf Ⅰ内切酶(1 U/μl)0.5 μl(TakaRa 中国)加水至20 μl,37 ℃酶切过夜,最后用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。

经过PCR扩增,扩增片段长度428 bp,因为Hinf Ⅰ内切酶在此片段上有两个酶切位点,因此无论C677T位点突变情况如何,首先此片段都会被切为34 bp和394 bp 2条。因此经Hinf Ⅰ酶切后,当C677T位点的基因型为TT时,产生3条带:34 bp、165 bp和229 bp;当C677T位点基因型为CC时产生2条带:34 bp和394 bp;当此位点为杂合(T/C)时产生4条带:34 bp、165 bp、229 bp和394 bp。由于34 bp片段在电泳时不明显,因此只能观察到其他条带,但已经能进行基因分型(见图1)。

1.3 血清Hcy水平测定 受检者空腹12 h以上,清晨抽取静脉血3 ml置于真空未抗凝试管中,在1 h内分离血清,剔除溶血、脂血、黄疸标本,严格按仪器操作程序进行检测,检测前用试剂配套定标样品进行定标,标本均在2 h内检测完毕。仪器使用日立7600-01大型全自动生化分析仪,由四川迈克生物科技股份有限公司提供Hcy检测试剂盒,采用循环酶法测定Hcy水平。

2 结果

2.1 一般资料 两组患者性别及Hcy水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);高血压组患者年龄、收缩压、舒张压较健康组升高,差异均有统计学意义(P<0.05,见表1)。

注:M:marker;1:TT等位基因型可见2条带165 bp和229 bp;2:CT等位基因型可见3条带165 bp、229 bp和394 bp;3:CC等位基因型可见1条带394 bp (34 bp片段太小电泳不可见)

图1 C677T经过PCR扩增片段Hinf Ⅰ酶切后电泳结果

Figure1 Electropherogram of C667T cut by PCR amplification fragment Hinf Ⅰ enzyme

表1 两组一般资料比较

注:*为χ2值,余检验统计量值为t值;Hcy=同型半胱氨酸

2.2 C677T等位基因频率分布 高血压组与健康组C677T等位基因频率分布比较,差异无统计学意义(χ2=0.32,P=0.57,见表2)。

2.3 C677T突变与Hcy水平相关性 显性模式和隐形模式不同基因型者Hcy水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05,见表3)。

表2 高血压组与健康组C677T等位基因频率分布〔n(%)〕

Table2 Distribution of allele frequency of C677T in MTHFR in health adults and hypertension patients

组别等位基因数CT高血压组266204(76.7)62(23.3)健康组268211(78.7)57(21.3)

表3 C677T突变与Hcy水平相关性

3 讨论

Hcy又称高半胱氨酸,于1931年由Vincent du Vigneaud首次从膀胱结石中分离得到,它是一种含硫的氨基酸,不属于组成蛋白质的20种氨基酸,本身不参与蛋白质的合成,也没有特异的3个DNA碱基对其进行编码,体内不能合成,它是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中重要的中间产物,只能来源于蛋氨酸(甲硫氨酸)的分解代谢。Hcy主要通过再甲基化和转硫基途径代谢。MTHFR、蛋氨酸合成酶(MS)、胱硫醚β合成酶(CBS)是Hcy代谢过程中的关键酶[1]。Hcy代谢酶的基因多态性可以影响酶的活性而影响血浆Hcy水平[2]。人类MTHFR基因定位于染色体1p36.3,全长1 980 bp,已发现具有高度多态性。该酶基因的C677T不耐热突变是产生轻中度高Hcy最常见的一个遗传决定因素[1]。在中国人中,脑卒中患者MTHFR基因纯合子突变和杂合子突变的发生率显著高于正常人,而T等位基因频率也明显高于正常对照组,说明MTHFR基因可能是脑卒中的易患基因之一。但也有研究显示MTHFR基因C677T突变是同型半胱氨酸血症的成因之一,但并不直接导致脑梗死,且与病程发展无关[3]。

较多的报道表明,Hcy通过多种作用机制导致血压升高[4-7]:(1)血中Hcy升高可以促进血管壁弹性纤维加速溶解,降低弹性纤维的含量,同时促进胶原纤维的合成,从而改变动脉壁弹性。(2)Hcy有促进平滑肌细胞增殖的作用,导致动脉壁的顺应性下降。(3)血Hcy可以诱导血管内皮细胞凋亡,促进细胞内超氧化物的生成,使依赖于NO的血管舒张功能受限,引起血压升高。(4)Hcy可以促进血管平滑肌细胞内钙离子的聚集,造成血管的收缩。另外,较多资料显示高血压与血浆Hcy水平有显著相关性[8-9]。

但是本研究表明,在傣族人群中,高血压患者并没有表现出较高的Hcy水平,与健康者之间没有差异,其原因可能与种群差异、饮食习惯等有关系。体内Hcy水平与饮食有着密切的关系,血浆中维生素B6、B12和叶酸水平越低,Hcy水平越高。

是否因为基因原因导致傣族人群Hcy水平表达偏低,从而导致高血压患者亦有较低的Hcy水平。本研究检测了Hcy的代谢酶MTHFR基因C677T等位基因频率,未发现两组间的差异。这说明,在傣族人群可能还存在其他保护基因导致Hcy的低表达。这些因素包括基因的种间差异、饮食结构、环境等。进一步研究少数民族与汉族之间关键基因的种间差异,对于预防甚至治疗脑血管疾病具有重要的现实意义。另外,由于本研究样本偏少,还需要进行较大规模的普查研究以进一步证实研究结论以及进行更深入的研究。

1 林小慧,李娜,董玉娟.同型半胱氨酸及其代谢酶基因多态性与动脉粥样硬化和脑梗死[J].国外医学脑血管疾病分册,2004,12(5):367-370.

2 岳红,王迎,张华屏,等.同型半胱氨酸及其代谢酶基因多态性与脑梗死的关系[J].山西医药杂志,2010,39(2):108-111.

3 杨凌宇,余华峰,杨凌,等.Hcy、MTHFR基因多态性与急性脑梗死关系的临床研究[J].中国康复理论与实践,2009,15(2):135-137.

4 Ralland PH,Friggi A,Barlatier A,et al.Hyperhomocysteinemia induced vascular damage in the minipig.C aptopril- hydrochlorothiazide combination prevents elastic alterations[J].Circulation,1995,91(4):1161-1174.

5 Buemi M,Marino D,Di Pasquale G,et al.Effects of homocysteine on proliferation,necrosis,and apoptosis of vascular smooth muscle cells in culture and influence of folic acid[J].Thromb Res,2001,104(3):207-213.

6 Faraci FM,Lentz SR.Hyperhomocysteinemia,oxidative stress,and cerebral vascular dysfunction[J].Stroke,2004,35(2):345-347.

7 Austin RC,Lentz SR,Werstuck GH.Role of hyperhomocysteinemia in endothelial dysfunction and atherothrombotic disease[J].Cell Death Differ,2004,11(1):S56-S64.

8 李观华,张启贵,刘晓峰,等.血清同型半胱氨酸与高血压之间关系的研究[J].国际检验医学杂志,2011,32(20):2411-2412.

9 Lim U,Cassano PA.Homocysteine and blood pressure in the Thrid National Health and Nutrition Examination Survey,1988-1994[J].Am J Epidemiol,2002,156(12):1105-1113.

猜你喜欢
傣族条带等位基因
文本图像条带污染去除的0稀疏模型与算法
亲子鉴定中Penta E稀有等位基因28的确认1例
受灾区域卫星遥感监测的条带分解方法研究
傣族服饰文化在现代生活的运用
亲子鉴定中男性个体Amelogenin基因座异常1例
巧用废旧条幅辅助“蹲踞式起跑”教学
广东汉族人群Penta D基因座off-ladder稀有等位基因分析
贵州汉族人群23个STR基因座的OL等位基因研究
傣剧与德宏傣族的文化记忆
构树与傣族传统造纸的保护和开发