吉西他滨联合溶瘤型腺病毒治疗大肠癌的体外研究

渠红霞，袁彩君，王 越

在世界范围内，大肠癌在癌症的病死率中排第4位，每年有100多万的大肠癌新发病例[1]，国内的发病率也呈上升趋势。大肠癌的治疗主要依靠手术，晚期治疗主要以化疗为主，但是疗效不甚理想，为了寻求新的治疗方法，全世界的研究学者把目光投向了溶瘤型腺病毒。溶瘤型腺病毒又称选择复制性腺病毒，其能够在肿瘤细胞中选择性复制，但不能在正常细胞中复制，因具有可复制、体积小、弥散能力强等优点，近年来成为肿瘤生物治疗的热点[2-3]。

目前研究较多的溶瘤型腺病毒是Barker和Berk研发的E1B缺失腺病毒ONYX-015。ONYX-015又称dl1520,是敲除了编码55 kDa蛋白的E1B区2496-3323核苷，且在E1B区的2022位点上C改变为T，使得dl1520感染的宿主细胞无法编码55 kDa蛋白[4]。因其具有众多优点已进入临床Ⅲ期试验[5]，同时已有研究表明，dl1520在与化疗药物联合应用时还可增加其疗效。与dl1520相似，ZD55同样是编码E1B 55 kDa核酸缺失型溶瘤型腺病毒，但是ZD55可携带外源抗肿瘤基因，ZD55的优点使得其被多数学者应用于溶瘤型腺病毒携带外源抗肿瘤基因的分子治疗。但是腺病毒的安全性部分是基于在人类正常细胞中复制缺陷的特性,而目前应用的溶瘤型腺病毒来自野生腺病毒,有一定回复突变的危险性[6]。因此鉴于腺病毒的特性，dl1520在治疗肿瘤时可能存在安全隐患。

盐酸吉西他滨(Gem)化学名为2′-脱氧-2′，2′-二氟胞苷盐酸盐(β-异构体)，是美国礼来公司研发的核苷类抗代谢抗肿瘤药物。有报道指出Gem与腺病毒联合应用时能获得良好的肿瘤细胞杀伤效果，且对病毒在细胞内复制有一定的抑制作用[7-8]。本研究以体外培养大肠癌细胞系HCT-116及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究模型，单独或联合应用Gem和E1B缺失溶瘤型腺病毒，观察其对肿瘤细胞的杀伤作用及安全性。

1　材料与方法

1.1实验材料dl1520、ZD55和重组腺病毒(Ad-GFP)购自上海信裕生物科技有限公司，HCT-116和HUVEC购自中科院上海细胞生物学研究所，MTT购自Biosharp公司，McCOY′s5A培养基购自GIBCO公司，高糖DMEM培养基、青链霉素(PS)及胎牛血清购于天津永大化学试剂有限公司，Gem购于江苏豪森药业股份有限公司，5氟尿嘧啶(5-Fu)购于南通海尔斯医药有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及药品制备细胞均采用贴壁培养法，HCT-116在McCOY′s5A培养基中培养；HUVEC在高糖DMEM培养基中培养，以上两种培养基均含10%胎牛血清、双抗(青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml)。细胞置37 ℃、5%二氧化碳(CO2)饱和湿度下培养，每2～3 d传代1次，培养至对数生长期(第3天)以0.25%胰酶消化进行实验。Gem或5-Fu用磷酸盐缓冲液(PBS)配制成合适浓度母液，过滤除菌后分装保存在4 ℃冰箱待用。

1.2.2病毒感染率的测定取对数生长期细胞HCT-116(1×105)与HUVEC(5×104),接种于24孔培养板中，24 h细胞贴壁后，弃掉完全培养基，用无血清培养基稀释Ad-GFP以感染复数(MOI)=0、1、10、100感染细胞，4 h后更换为完全培养基继续培养，感染72 h后在荧光显微镜下计数绿色荧光蛋白(GFP)细胞，同时在可见光下计数该视野内的总细胞数，实验重复3次，计算感染率。感染率=GFP阳性细胞数/该视野内的总细胞数。

1.2.3细胞存活实验取对数生长期细胞HCT-116和HUVEC分别以1×104cell/孔、5×103cell/孔的密度接种于96孔培养板，培养24 h，待细胞贴壁生长良好后吸去培养基，按实验分组加入病毒和(或)药物。实验设3个大组、8个小组：(1)单独病毒组:dl1520组和ZD55组；(2)联合组：dl1520联合Gem组、ZD55联合Gem组、dl1520联合5-Fu组、ZD55联合5-Fu组；(3)单药组：Gem组和5-Fu组。前两大组均以MOI=10的无血清培养基稀释的相应病毒100 μl/孔感染上述细胞，单药组以无血清培养基饥饿4 h后，与前两组一起更换为完全培养基，置于37 ℃，5%CO2孵箱内培养24 h，在联合治疗组中，感染24 h后加入Gem或5-Fu，药物浓度为10 μmol/L，在单药治疗组中细胞铺板48 h后加入Gem或5-Fu，药物浓度为10 μmol/L。设3个复孔，四周孔及间隙加无菌PBS 100 μl保湿，于37 ℃、5%CO2孵箱内培养72 h，铺板5 d后(即感染4 d后)结束实验，加入MTT(5 mg/ml)10 μl/孔，37 ℃孵育4 h后小心吸弃孔内上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)100 μl/孔，振荡10 min，用酶标仪测570 nm波长吸光值，根据以下公式计算细胞存活率，细胞存活率(%)=(实验组OD均值-空白对照组OD均值)/(细胞对照组OD均值-空白对照组OD均值)×100%。

1.2.4细胞形态学观察取对数生长期细胞HCT-116和HUVEC分别以1×105cell/孔、5×104cell/孔，接种于24孔培养板中，24 h细胞贴壁后，弃单药组，按上述细胞存活实验分组感染病毒及加入药物。铺板5 d后(即感染4 d后)结束实验，于倒置显微镜下观察、拍照。

1.2.5病毒滴度检测取对数生长期细胞HCT-116和HUVEC分别以1×105cell/孔、5×104cell/孔，接种于24孔培养板中，24 h细胞贴壁后，弃单药组，按上述细胞存活实验分组感染病毒及加入药物。铺板5 d后(即感染4 d后)结束实验，收集各组细胞，PBS洗3次，-80 ℃冻溶3次，离心，取上清液，用TCID50测定病毒滴度，Karbers公式计算病毒滴度。

2　结果

2.1病毒感染率测定MOI=100时，HCT-116和HUVEC对腺病毒的感染均较敏感，且细胞的感染率均达到90%以上(见图1)。

2.2细胞存活率不同组HCT-116和HUVEC存活率比较，差异均有统计学意义〔F=18.546,P=0.000,95%CI(68.318,88.285)；F=37.079,P=0.000,95%CI(81.618,92.737)，见表1〕。

表1不同组HCT-116和HUVEC细胞存活率比较(%)

Table1Comparison of HCT-116 and HUVEC cells survival rate in different groups

组别HCT-116HUVECdl1520组84.5293.99ZD55组84.2985.92dl1520联合Gem组62.1081.20ZD55联合Gem组65.1080.80dl1520联合5-Fu组73.1083.70ZD55联合5-Fu组72.1081.10Gem组90.1094.265-Fu组95.1096.45

注：HUVEC=人脐静脉内皮细胞

2.3细胞形态学HCT-116和HUVEC dl1520联合Gem组和5-Fu组均可部分杀伤细胞，ZD55联合Gem组细胞杀伤效果略逊于dl1520联合Gem组，dl1520组和ZD55组中只可少部分杀伤细胞(见图2、3)。

2.4滴度检测和病毒复制实验MTT实验显示，大肠癌细胞系HCT-116中dl1520联合Gem组、ZD55联合Gem组分别比dl1520组、ZD55组病毒滴度降低约400倍、50倍，dl1520联合5-Fu组、ZD55联合5-Fu组比dl1520组、ZD55组降低不明显；正常细胞系HUVEC中病毒滴度降低不明显(见图4)。

图4　TCID50检测

图1　MOI=100时细胞感染率

图2　HCT-116细胞形态学实验(光学显微镜，×400)

图3　HUVEC细胞形态学实验(光学显微镜，×400)

3　讨论

目前溶瘤型腺病毒治疗肿瘤已成为当今的热点之一，许多临床试验已证实溶瘤型腺病毒对多种恶性肿瘤都有一定的治疗效果，包括颅脑肿瘤、头颈部肿瘤、腹膜转移肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肝脏肿瘤、骨肉瘤、肾脏肿瘤等[9-17]。而dl1520是溶瘤型腺病毒中研究最深入最广泛的一种类型，是2型血清腺病毒与5型血清腺病毒的嵌合体，有许多学者认为dl1520的选择复制机制与P53的功能突变有关，但并不仅限如此[18]。腺病毒dl1520进入肿瘤细胞后病毒大量复制,最终导致肿瘤细胞凋亡[19-20]。在肿瘤破裂时大量病毒被释放，而当病毒数量达到一定程度时就可能会对人体产生一些目前还未完全了解的危害或疾病，因此其在治疗肿瘤方面可能存在很多安全隐患。

本研究就是针对腺病毒在治疗大肠癌时在保证杀伤效果不受影响的前提下如何抑制病毒增殖所做的研究，通过在一定程度上抑制病毒复制来提高腺病毒治疗大肠癌的安全性。在本实验中，各联合组对大肠癌细胞系HCT-116的细胞杀伤作用虽然无差异，但是值得关注的是dl1520联合Gem时病毒在大肠癌细胞系HCT-116内病毒滴度比单独应用dl1520时降低约400倍，而dl1520联合5-Fu时，没有观察到病毒滴度明显降低，这就说明Gem与dl1520联合应用能使细胞内病毒复制减弱，而5-Fu则不能。虽然Gem与5-Fu相比单独或联合应用时在杀伤肿瘤细胞效果上无差异，而Gem与溶瘤型腺病毒的联合应用在治疗大肠癌上的意义是毋庸置疑的，这就说明dl1520联合Gem治疗大肠癌是有意义的，而其中最引人注目的是二者的联合应用能抑制细胞内病毒增殖，进而提高了溶瘤型腺病毒在治疗大肠癌的安全性。然而与dl1520相比，ZD55联合Gem或5-Fu治疗大肠癌细胞系HCT-116时，其病毒滴度无明显降低。与ZD55相比dl1520是嵌合型腺病毒，而ZD55是由野生型腺病毒构建而来，假设ZD55更加接近野生血清5型腺病毒，相对来讲可能更加难以被抑制。

已有研究证实5-Fu、顺铂等药物不能抑制病毒的复制[4]，但是5-Fu联合溶瘤型腺病毒能够有效提高治疗大肠癌的疗效。同时已有学者证实溶瘤型腺病毒突变体与Gem联合应用在一定程度上能够抑制病毒复制，机制可能为病毒溶瘤早期细胞膜破裂后引起的化疗药物的渗透和(或)线粒体功能失调而导致的细胞死亡[20]，从而导致病毒不能在肿瘤细胞中复制。也有学者认为导入外源基因磷酸化Gem等核苷酸类似物、掺杂入DNA链或RNA链可阻止病毒在细胞中的大量复制。本研究结果与上述的观点有相对一致性，认为除了上述原因外，人类癌细胞的核苷酸激酶具有一部分催化Gem等核苷酸类似物的活性，从而抑制病毒增殖的作用，但是具体机制及改建后的溶瘤型腺病毒的复制因素仍需进一步研究。

Gem联合dl1520治疗大肠癌比单独应用dl1520治疗大肠癌有效，且在疗效上与5-Fu的联合无差异，但是与Gem的联合能够提高其安全性；而dl1520与5-Fu的联合则不能提高其安全性，ZD55与Gem和5-Fu的联合也说明了这点。本研究可能为将来大肠癌新的治疗方法提供一定的依据，但是本实验尚有不足之处，现在仅处于基础研究阶段，而目前dl1520联合Gem能够降低病毒滴度的机制不十分清楚，可能与Gem是核苷酸类似物，进而影响DNA合成有关，这还需要进一步的研究。

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