普伐他汀与阿托伐他汀对急性损伤大鼠心肌细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

孙晓靖，陈玉岚，张向阳，杨少玲，黄 定，王 红，张 宇，倪国华，赵 龙，陈 容

心肌梗死后可发生代偿性的心室重构,心肌细胞凋亡可导致左心室舒张功能障碍,其贯穿于心肌梗死后心室肥大及心力衰竭的发展过程[1]。近年来有研究发现，他汀类药物有改善心力衰竭及逆转心室重构的作用,可诱导血管平滑肌细胞凋亡[2]。本研究旨在探讨普伐他汀与阿托伐他汀预先干预对异丙肾上腺素急性损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响及对凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的影响。

1　材料与方法

1.1分组选取体质量为(200±20) g的 140只雌性普通级SD大鼠,适应性喂养2 d后按照随机数字表分为6组：28只采用0.9%氯化钠溶液灌胃(ISO组)，24只按30 mg/kg给予阿托伐他汀灌胃(L30组)，24只按10 mg/kg给予阿托伐他汀灌胃(L10组)，24只按120 mg/kg给予普伐他汀灌胃(P120组)，24只按40 mg/kg给予普伐他汀灌胃(P40组)，16只给予0.9%氯化钠溶液灌胃(对照组)。

1.2方法每组每只大鼠每日灌胃1次，3 d后，对前5组大鼠分别皮下注射异丙肾上腺素300 mg/kg，对照组大鼠皮下注射0.9%氯化钠溶液，分别于注射6 h和72 h时在每组大鼠中取8只进行血流动力学监测,同时检测其Bcl-2和Bax的表达。

1.3血流动力学指标测定按3 ml/kg的标准腹腔注射0.3%水合氯醛溶液进行麻醉，将大鼠取仰卧位并适当固定，剪毛并对右颈部术区进行常规消毒。在术区作一大小合适的切口,分离颈总动脉并置管,连接生理记录仪,记录血流动力学各项指标。

1.4心肌组织学检查仔细记录压力曲线，然后将大鼠心脏取出并洗净，称量滤纸吸干后的左室质量(LVW)，以左室质量指数 (LVWI)作为左心室重塑指标。

1.5免疫组化测定采用甲醛溶液常规固定左室心肌并进行连续石蜡切片，脱蜡,至水,封闭内源性过氧化物酶，采用抗原热修复,然后滴加按1∶100稀释的一抗工作液(Santa Cruz Biotechnology，美国)，将其置于湿盒内并放置在4 ℃冰箱过夜，PV-6001工作液在25 ℃下孵育，二氨基联苯胺(DAB)显色，复染，脱水，透明后封片[3]。采用400倍的光镜观察，结果判断标准:细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。随机选择5个阳性表达最强区的高倍视野计数阳性细胞总数和细胞总数,阳性表达率=阳性细胞数/细胞总数×100%，并求其平均值。

2　结果

2.1造模情况大鼠注射异丙肾上腺素后共死亡37只(28.9%),其中27只在第1天内死于急性左心力衰竭(ISO组10只,阿托伐他汀组7只，普伐他汀组10只),在解剖时发现双侧肺淤血伴或不伴有胸腔积液,另外10只于第2天死亡(5组各2只),对照组均未死亡。

2.2心肌重塑指标的改变与对照组比较，在注射异丙肾上腺素6 h和72 h时，其他5组大鼠体质量均减少，差异有统计学意义(P<0.05)；在72 h时，ISO组、P120组及P40组的LVW和LVWI与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table1Changes of weigth and cardiac remodeling indexes after the statins intervention in the rats which isoproterenol-induced acute injury

组别只数体质量(g)6h　　　72hLVW(mg)6h　　　72hLVWI(mg/g)6h　　　72h对照组8211±11　209±13　462±26461±42　22±02　23±01　ISO组8200±11∗190±13∗480±27550±61∗24±02　29±03∗L30组8202±11∗192±10∗470±47514±68　23±01　24±03　L10组8200±13∗194±10∗470±48513±46　24±02∗24±02　P120组8202±12∗190±8∗469±45540±30∗24±02∗29±02∗P40组8196±13　186±14∗462±42550±82∗23±01∗30±02∗F值4346111636685293175P值<005<005>005<005<005<005

注：与对照组比较，*P<0.05；LVW=左室质量，LVWI=左室质量指数

2.3血流动力学比较与对照组比较，无论在注射异丙肾上腺素后6 h时还是72 h时，其他5组大鼠心率均加快，主动脉平均压及左室内压变化速率(dp/dtmax)均降低，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.4Bax和Bcl-2表达的比较与对照组比较，在注射异丙肾上腺素12 h时，其他5组Bcl-2表达增高；在注射异丙肾上腺素后6 h及72 h时，其他5组大鼠Bax表达均增高，差异有统计学意义(P<0.05)；在72 h时，L10组、P120组和P40组Bax/Bcl-2较对照组增高，差异均有统计学意义(P<0.05，见表3)。

Table3Changes of Bax,Bcl-2 expression after statins intervention in the rats which isoproterenol-induced acute injury

组别只数Bcl-2(%)6h　　　72hBax(%)6h　　　72hBax/Bcl-26h　　　72h对照组821±920±11　11±9　12±9　065±039070±039　ISO组830±941±9∗39±15∗57±23∗129±088149±070　L30组828±944±15∗27±12∗48±15∗100±039120±051　L10组834±1140±16∗36±16∗51±13∗140±048160±076∗P120组829±1137±20∗24±10∗53±19∗121±076169±065∗P40组831±1040±16∗31±10∗54±16∗112±048159±064∗F值241962146922932101221P值>005<005<005<005>005<005

注：与对照组比较，*P<0.05

表2　他汀类药物干预对异丙肾上腺素急性损伤大鼠血流动力学的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；dp/dtmax=左室内压变化速率

3　讨论

研究证实，他汀类药物对血管平滑肌细胞有诱导凋亡的作用，近年有学者研究发现，他汀类药物能提高血管内皮功能，促进血管内皮细胞释放氧化亚氮，增强冠状动脉对二氧化氮(NO2)依赖的血管舒张及调节功能[4]。也有研究结果显示，他汀类药物有明显的抗血栓形成作用，除此以外，还有显著的抗炎作用[5]。Tanaka等[6]学者观察到阿托伐他汀对蛋白激酶C抑制剂诱导培养的大鼠心肌细胞凋亡具有明显的阻断作用。Ogata等[7]在比较普伐他汀与氟伐他汀对培养鼠心肌细胞增殖影响的实验研究中发现，普伐他汀对大鼠心肌细胞的诱导凋亡作用不存在明显的时间及剂量依赖性，而氟伐他汀与普伐他汀不同，存在明显的时间及剂量依赖性。国外有学者报道，长期服用他汀类药物可减少心肌肥厚和纤维化，可明显改善心功能[8]。Hasegawa等[9]观察到对长期喂饲高盐膳食的Dhal盐敏感大鼠西采用立伐他汀灌胃，能显著减轻大鼠心室肥大、心肌纤维化，同时，还可显著减少白介素1等各种炎性递质的表达，保护心肌，从而避免或延缓心力衰竭的发生和发展。上述各学者研究结果各异，提示他汀类药物作用于心肌细胞，对其凋亡的作用及影响颇为复杂[10]。

从本研究结果可以看出，在ISO组、L30组、L10组、P120组、P40组大鼠注射异丙肾上腺素6 h后，较对照组大鼠心率明显增加，而主动脉平均压较对照组均降低。引起这一结果的原因可能为短时间内经皮下大量注射异丙肾上腺素使心脏过度兴奋，四肢静脉血管扩张明显，大量血液滞留在外周循环血管，静脉回心血量减少，引起心输出量减少。但在注射异丙肾上腺素72 h后，注射异丙肾上腺素的各组大鼠与对照组比较，心率仍然加快，主动脉平均压较6 h时有所回升，但相比对照组而言，仍然降低，但均无统计学意义。在注射异丙肾上腺素后6 h和72 h时，各组体质量较对照组均明显减轻；72 h时ISO组、P120组及P40组与对照组比较，LVW和LVWI均明显增加。而L30组与L10组LVW和LVWI较对照组而言无明显增加。与对照组比较，其与5组在注射异丙肾上腺素6 h后，Bax表达明显增高，在72 h后Bax表达进一步增高，L10组、P120组及P40组Bax/Bcl-2较对照组明显增高。

1宋洁,牛凡,王伟，等.普伐他汀与阿托伐他汀对大鼠心梗后胞外基质重构及基质金属蛋白酶的影响[J].广东药学院学报,2007,23(6):673-675,678.

2张巍,赵明,王小凤，等.大剂量阿托伐他汀对急性心肌梗死行急诊PCI患者心肌再灌注损伤的影响[J].现代预防医学,2011,38(21):4545-4547.

3吴志勇,漆红梅,盛国太，等.氟伐他汀对心肌梗死后大鼠心肌细胞Fas蛋白表达及心室重塑的影响[J].中国老年学杂志,2011,31(13):2487-2489.

4Sanguigni V,Pignatelli P,Lenti L,et al.Short-term treatment with atorvastat in reduces platelet CD40 ligand and thrombin generation in hyper cholesterolemic patients[J].Circulation,2005,111(4):412-419.

5周平,李法琦,张彬，等.辛伐他汀对高脂血症大鼠心肌细胞内质网应激相关凋亡的影响[J].中国老年学杂志,2010,30(11):1545-1548.

6Tanaka K,Honda M,Takabatake T.Anti-apoptotic effect of atorvastatin,a 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase inhibitor,on cardiac myocytes through protein kinase C activation[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2004,31(5/6):360-364.

7Ogata Y,Takahashi M,Takeuchi K,et al.Fluvastatin induces apoptosis in rat neonatal cardiac myocytes:a possible mechanism of statin-attenuated cardiac hypertrophy[J].J Cardiovasc Pharmacol,2002,40(6):907-915.

8Erl W,Hristov M,Neureuter M,et al.HMG-CoA reductase inhibitors induce apoptosis in neointima-derived vascular smooth muscle cells[J].Atherosclerosis,2003,169(2):251-258.

9Hasegawa H,Yamamoto R,Takano H,et al.3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors prevent the development of cardiac hypertrophy and heart failure in rats[J].J Mol Cell Cardiol,2003,35(8):953-960.

10陈海荣.阿托伐他汀对急性心肌梗死患者血清高敏C-反应蛋白的影响[J].现代预防医学,2011,38(18):3814-3815.