肿瘤干细胞标志CD166在结肠癌中的表达及其临床生物学意义

张钧书 王科 黄建

肿瘤干细胞标志CD166在结肠癌中的表达及其临床生物学意义

张钧书 王科 黄建

目的探讨肿瘤干细胞标志CD166在原发结肠癌组织中的表达及其临床生物学意义。方法收集57例患者的原位结肠癌组织，应用免疫组织化学检测其CD166表达。应用流式细胞分选（FACS）技术，以CD166/CD133标志分选结肠癌细胞株SW620，通过NOD/SCID小鼠脾脏移植，观察肝转移情况。结果CD166可表达于结肠癌细胞的细胞质和细胞膜，其中细胞质阳性率98.2%（56/57），细胞膜阳性率42.1%（24/57）。膜CD166阳性表达与局部浸润（P=0.010）、pTNM分期（P=0.035）、远处转移（P=0.013）、年龄（P=0.026）相关；而与性别（P=0.426）、淋巴结转移（P=0.104）、肿瘤分化（P=0.171）无相关性。Log-rank生存分析显示：结肠癌细胞膜CD166阳性表达与患者生存期（P=0.014）呈负相关。动物实验的初步结果显示：脾包膜接种CD166阳性的SW620细胞可形成肝转移灶。结论CD166阳性表达与肿瘤局部进展和远处转移有关，是判断预后不良的标志，CD166阳性的肿瘤细胞可能具有肝转移潜能。

结肠癌 CD166 CD133 预后 肝转移

结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位，发病率有逐年上升的趋势[1]。由于早期无症状，相当数量的患者发现肿瘤时已处于中晚期，从而导致治疗效果不佳，外科手术和放、化疗均不能彻底根除体内存留的肿瘤细胞[2]。目前大部分研究结果显示肿瘤组织中存在极少数具有无限增殖和自我更新能力，可导致肿瘤发生的细胞，即肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC）。CSC可能是肿瘤发生、转移、复发和耐药的主要因素[3-4]，近年来已成为肿瘤的研究热点，CSC分子标志物表达在治疗选择和预后判断上具有重要意义。研究显示CD166可能是结肠癌干细胞标志之一，本研究通过免疫组织化学检测结肠癌组织CD166的表达，了解其与肿瘤浸润、转移和预后的关系；并以CD166标志分选结肠癌细胞株SW620，移植入NOD/SCID小鼠脾脏，观察其肝转移的能力。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2007-01—2010-01在浙江省临安市人民医院手术的57例结肠癌患者的石蜡标本，经浙江大学附属第二医院病理科医师确诊，所有患者术前未接受放、化疗，临床病理资料完整。其中男37例，女20例，年龄33～86岁，平均64.5岁。病变部位左半结肠34例，右半结肠23例。按全国结直肠癌协作组标准进行组织学分类，其中高分化7例、中分化28例、低分化22例。浸及浆膜和浆膜外组织54例，未超过肌层3例。有淋巴结转移25例，无淋巴结转移32例。TNM分期参照美国癌症联合会癌症分期手册2010年第7版，Ⅰ期3例、Ⅱ期27例、Ⅲ期20例、Ⅳ期7例。57例中失访5例，死亡12例。18例远处转移，依次是肝脏、腹腔、腹膜、肺，其中肝转移10例。

1.2 实验动物 5周龄雄性NOD/SCID小鼠，体重20g左右，购自中科院上海动物实验中心，饲养于浙江中医药大学动物实验中心无特殊病原体（specific pathogen free,SPF）级动物房。

1.3 主要试剂及仪器 兔抗人 CD166浓缩型单克隆抗体（工作液浓度1∶50），购自英国abcam公司；即用型免疫组化试剂盒（SP-9000）,购自福州迈新生物有限公司。人结肠腺癌细胞SW620，由浙江大学肿瘤研究所提供。流式分选用鼠抗人CD166单克隆抗体、PE羊抗鼠免疫球蛋白均购自美国BD公司；CD133/2(AC14l)-FITC荧光抗体购于德国Miltenyin公司；流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.4 方法

1.4.1 免疫组织化学检测结肠癌组织中CD166表达具体操作按试剂盒说明书进行，DAB显色。结果判断：细胞膜和细胞质分别判断，出现黄色颗粒为阳性，计算阳性细胞占视野细胞数的百分比，阳性细胞数＜10%为阴性，10%～49%为+，50%～74%为++，＞75%为+++。并请2位病理科医师双盲确认。

1.4.2 细胞培养及分选 人结肠癌细胞株SW620采用RPMI1640完全培养液，在37℃、5%CO2孵箱中贴壁培养。收集2×106个细胞，用冷的PBS 2ml洗涤1次后，以含2%FBS的PBS封闭10min，分成5管（CD133、CD166、CD133/CD166、对照、空白）。加入一抗后，冰上避光放置30min，洗涤去掉未结合的一抗。加入荧光标记的二抗，冰上避光放置10min后，洗涤两次。取500μl细胞悬液上流式细胞仪分析。同时准备3μl无血清培养液用于细胞分选。

1.4.3 动物实验 采用0.5%的戊巴比妥钠50mg/kg，小鼠腹腔内注射麻醉，麻醉成功后用胶布将小鼠固定于手术台上。皮肤消毒后左侧肋缘下行0.5～1cm切口，进腹后找到柳叶状脾脏，牵出腹腔外，用1ml注射器从脾下极进针，将瘤细胞液0.1ml注射于脾内，拔针后，酒精棉球按压针眼，轻轻按揉脾脏5min，使瘤细胞经脾静脉进入肝脏，注射区苍白隆起消失后，结扎脾血管及胃短动、静脉，切除脾脏并关腹。麻醉清醒后常规饲养。定期观察小鼠的一般状况。所有小鼠饲养至自然死亡或至第8周行颈椎离断法处死。解剖后观察有无肝脏及其他部位转移，取出肝脏及有转移的组织,以4%甲醛固定。石蜡包埋后切片，HE染色。

1.5 统计学处理 采用2.15.0版R统计软件，计量资料以表示。计数资料用χ2检验及Spearman等级相关分析，对生存数据进行Kaplan-Meier分析并绘制生存曲线，应用Log-rank检验差异性。

2 结果

2.1 结肠癌组织中CD166表达 免疫组化结果提示57例结肠癌组织中细胞质表达阳性率为 98.2%（56/ 57），细胞膜阳性表达率为42.1%（24/57）（图1，见插页）。

2.2 结肠癌细胞膜CD166表达与临床病理学特征的关系 本研究结果显示年龄≥65岁的患者结肠癌组织 CD166阳性率明显高于＜65岁者（P＜0.05）。CD166阳性表达亦与浸润深度有关，T3、T4患者CD166阳性率明显高于T1、T2患者（P＜0.05），CD166阳性表达还与结肠癌远处转移和TNM分期有关（均P＜0.05）。而与性别、分化程度、淋巴结转移无关（均P＞0.05），见表1。

2.3 结肠癌细胞膜CD166表达与患者预后的关系Kaplan-Meier生存分析发现CD166阴性表达患者生存时间明显高于阳性患者（P＜0.05），相对风险0.23（95%可信区间0.0724～0.741），见图2。

2.4 SW620细胞流式分选结果 以CD166/CD133为标志，分选SW620细胞得出CD166+/CD133+的SW620细胞占 27.7%，CD166+/CD133-细胞 16.8%，CD166-/ CD133+细胞33.8%，而CD166-/CD133-细胞21.6%。

2.5 NOD/SCID小鼠肝脏转移结果 脾包膜注射2×106个未分选SW620细胞和2×105个CD166-细胞的小鼠未出现肝转移（0/2、0/1、0/1），而注射2×105个CD166+/ CD133+和CD166+/CD133-细胞可发生肝转移（3/3、2/3）（图3，见插页）。

表1 结肠癌细胞膜CD166表达与临床病理特征关系[例（%）]

图2 结肠癌CD166表达与患者生存曲线

3 讨论

近年来，CSC已成为肿瘤研究的热点之一，在结直肠癌细胞中首先发现了一些CD133阳性的细胞，其所占比例很小，但是有很强的增殖能力，具有CSC特征。随着研究的深入，陆续发现了CD44、EpCAM、CD166等结直肠癌CSC的标志物[5-6]。研究证实一些CSC标志物与肿瘤临床指标相关，如目前已发现CD133、CD26等CSC的分子标志与其肝转移相关，其高表达提示结肠癌预后不良[7-12]。而CD166分子在结肠癌中的表达和生物学意义研究报道不多且有争议，需进一步研究阐明。

CD166（ALCAM）是分子量为65KDa细胞黏附分子，属于免疫球蛋白超家族。在活化的白细胞、神经细胞、上皮细胞和血液前体细胞中存在生理性表达[13]。在肿瘤组织中，首先发现CD166是恶性黑色素瘤疾病进展有价值的预后判断指标[14-15]。近来有学者报道在结肠癌中细胞膜CD166表达与肿瘤进展密切相关，是预后不良的判断指标[16-17]。但Lugli等[18]应用免疫组织化学检测发现胞膜不表达CD166、CD44的结肠癌细胞具有更高浸润性和淋巴转移率，与生存期降低相关。本研究显示结肠癌细胞质CD166阳性表达98.2%，但生物功能及意义尚不清楚。在结肠癌细胞膜阳性表达42.1%，并与肿瘤浸润、远处转移呈正相关，阳性患者生存期较阴性者降低，并具有统计学差异。而与淋巴结转移和肿瘤分化无关，但需更多病例数证明。Patel等[19]研究发现CD44、CD166膜阳性细胞局限分布于腺管周围，并随着年龄的增长，CD44、CD166的表达更加强。本研究也显示在高龄结肠癌患者CD166阳性表达增加，其原因尚不清楚。

CD166已知作为CD6的配体参与上皮细胞间的黏附作用[20]。在部分结肠腺瘤和结肠癌细胞膜上表达，可能通过同嗜性和异嗜性黏附介导细胞与细胞的相互作用，参与机体多种病理生理过程，在肿瘤的进展，主要是在肿瘤的转移过程中可能起重要作用。免疫组织化学研究发现，结肠癌细胞膜CD166阳性患者具有更高转移发生率，主要是肝转移。为进一步验证CD166阳性结肠癌细胞转移能力，笔者以CD166和CD133为标志应用FACS技术分选结肠癌细胞SW620，经脾移植NOD/ SCID小鼠观察肝转移情况，并与未分选SW620细胞比较。初步结果显示CD166+细胞比未分选或CD166-细胞具有更强的肝转移能力，推测CD166可能是独立的转移预测的标志。

总之，本研究提示在结肠癌中CD166+细胞具有较强的转移能力，CD166可能是肿瘤预后的新标志物和治疗的潜在靶点，尚需积累更多病例，进一步体内外研究证明。

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Expression of CD166 in colon cancer and its biological significance

ObjectiveTo investigate the expression and biological significance of CD166 in primary colon cancer.MethodsThe expression of CD166 was detected by immunohistochemistry in tissue specimens from 57 patients with colon cancer of various pTNM stages.Human colon cancer SW620 cells were screened for positive expression of CD166 and CD133.The CD166 and CD133-positive SW620 cells were inoculated in spleen of NOD/SCID mice;then the ability of liver metastases of transplanted SW620 tumors was evaluated.ResultsThe CD166 was positively expressed in cytoplasm and membrane of colon cancer cells, being 98.2%(56/57)in cytoplasm and 42.1%(24/57)in membrane of cancer cells.CD166 membrane expression was significantly associated with older age(P=0.026),tumor stage(P=0.035),and distance metastasis(P=0.013),not with gender(P=0.426),lymph node metastasis(P=0.104)and tumor differentiation(P=0.171).Log-rank survival analysis revealed that CD166 membrane expression was negatively correlated with the survival of patient(P=0.014).The results of the animal experiments demonstrated metastatic growth in the liver after splenic capsule injection CD166+SW620 cells.ConclusionThe expression of membrane CD166 is associated with poor clinical outcome and short survival in the patient with colon cancer.CD166+colon cancer cells may have a potential of liver metastasis.

Colon cancerCD166 CD133 Prognosis Liver metastases

2012-12-04）

（本文编辑：胥昀）

教育部博士点基金资助项目（20100101110124）

310009 杭州，浙江大学医学院附属第二医院肿瘤外科（张钧书、王科、黄建，张钧书系在职硕士研究生，现在临安市人民医院普外科工作）

张钧书，E-mail：zhjunshu@163.com