解耦联蛋白2(UCP2)与胰岛β细胞功能研究进展

顾 迁(综述) 高 鑫(审校)

(1复旦大学附属中山医院老年科，2内分泌科 上海 200032)

在2型糖尿病的病理生理过程中，胰岛β细胞功能持续恶化是其发生、发展的重要因素。生理环境下，胰岛β细胞遵循独特的工作模式，它并不像机体多数细胞一样利用葡萄糖的代谢来维持细胞内ATP/ADP比值，而是感受不同的葡萄糖水平，通过线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential，MTP，ΔΨm)的变化，改变细胞内 ATP/ADP比值，并将此作为调控胰岛素分泌的信号，协调机体各组织对营养物质的利用［1］。伴随着β细胞线粒体呼吸作用、氧化磷酸化合成能量分子ATP的同时，呼吸链中有适量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)形成，是β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose stimulated insulin secretion，GSIS)的必要分子信号［2］;但在慢性高糖环境下，ROS产生过多，对β细胞造成氧化应激损伤，抑制β细胞的功能与生存［3－6］。β细胞线粒体 ΔΨm是调控细胞内ATP/ADP比值及线粒体ROS水平的关键因素。解耦联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)属于线粒体UCP家族成员，其本质是线粒体内膜上的质子(H+)通道，在激活后可产生H+渗漏，即使H+从线粒体内膜外的胞液面回到线粒体内膜内的基质面，这一作用可调节β细胞密切依赖的线粒体ΔΨm水平，目前积累的研究证据亦支持UCP2的解耦联作用可对β细胞功能产生调控［7－9］。本文将总结现有针对UCP2调控胰岛β细胞功能的体内、外研究结果及UCP2可能的作用机制和途径。由于从β细胞感受葡萄糖到其分泌胰岛素的过程中，UCP2是一个重要的调节因子，因此阐明这种精细的调控作用可使UCP2成为颇具潜力的改善β细胞功能、治疗2型糖尿病的分子靶点。

解耦联作用与β细胞 线粒体是细胞能量代谢的中心，是底物氧化与ATP合成耦联的场所。电子在线粒体内膜呼吸链上传递给氧生成水时，是个强烈的放能反应，这些能量可以用于线粒体内膜两侧质子(H+)的转位，即H+从线粒体的基质面被泵出至线粒体内膜外的胞液面，形成线粒体ΔΨm，当H+从胞液面顺梯度回至基质面时，这部分能量可推动ATP合成酶将ADP磷酸化合成能量分子ATP。但在线粒体中，底物氧化与ADP的磷酸化耦联作用并不是完全的，在线粒体内膜上存在质子渗漏的通道，由于这些通道的存在，H+被转运回线粒体内膜内，而没有用于合成ATP，称为氧化磷酸化解耦联作用。根据不同的细胞类型，解耦联作用所消耗的能量可占线粒体呼吸作用总能量的20% ～70%［10］。细胞中为何要存在如此巨大的能量耗损?解耦联现象在生物进化过程中一直存在，现在认为这种作用可使细胞的能量代谢能够随着机体整体的能量稳态做出调节以适应机体功能需求。例如在一些特定的细胞内发挥适应性产热(棕色脂肪组织)，在低ATP需求时维持碳的流动以及调节葡萄糖感受细胞内的营养物质代谢反应等作用［1］。也有学者提出“为生存而解耦联”假说:各组织细胞为避免被线粒体能量代谢过程中产生的过量ROS损伤，通过解耦联作用降低线粒体ΔΨm以减少ROS产生［11］。在体内组织中，UCP2是继腺嘌呤核苷酸转位酶(adenine nucleotide translocase，ANT)、UCP1 后发现的具有介导H+转运、产生解耦联作用的线粒体内膜蛋白［12］。多数研究结果表明UCP2不参与基础状态下线粒体氧化磷酸化的解耦联，仅在特定因素，如高糖、高脂肪酸等激活后产生解耦联效应［13］。胰岛β细胞的线粒体处于一种高度解耦联的工作状态，其氧化磷酸化耦联的效率估计仅在30%左右［1］。Affourtit等［14］研究发现，胰岛β细胞株INS-1E细胞线粒体内膜的质子渗漏比小鼠骨骼肌细胞高出4倍，而UCP2所致的解耦联作用占INS-1E细胞系线粒体呼吸作用的20%，这种高度的质子渗漏强有力地控制着线粒体ΔΨm，继而改变ATP/ADP比值和线粒体ROS水平，调控β细胞的生理功能。

UCP2的分布和调节 自1997年克隆UCP2基因以来，相继在多种组织中检测到了UCP2 mRNA:包括脾脏、下丘脑、胰腺(β细胞、α细胞)、心脏、肺、白色及棕色脂肪组织、胃、睾丸、巨噬细胞;而在脑、肾脏、肝脏、肌肉等组织中则发现相对少量的UCP2 mRNA［15］。由于UCP2基因在巨噬细胞中有表达，而巨噬细胞又可以在体内游走，因此UCP2的表达是否如此广泛仍不确定。用Western blot法检测UCP2蛋白的实验显示，UCP2蛋白的存在远没有mRNA广泛，仅在脑、脾脏、白色脂肪组织、胰岛的实质细胞及巨噬细胞中检测到了UCP2蛋白。值得注意的是，UCP2基因在某些器官中生理情况下并不最终表达为蛋白，而在病理状态下却可以启动UCP2 mRNA翻译为蛋白:如在肝脏中，生理情况下UCP2蛋白仅在Kuffer细胞中表达，而在肝细胞脂肪变性后，肝细胞内可普遍表达UCP2蛋白［15］。Hurtaud 等［16］研究发现，在体外巨噬细胞、胰腺β细胞中，UCP2 mRNA与UCP2蛋白水平的变化并不一定同步。Chan等［17］最早表明在小鼠胰岛中存在丰富的UCP2 mRNA与UCP2蛋白。在INS-1E细胞系中，常规培养液(RPMI培养液)下用免疫沉淀方法测得的UCP2浓度为8 ng/mg线粒体蛋白［13］。

UCP2在细胞内的效应受UCP2基因表达、翻译和UCP2蛋白活性的影响。在INS-1E细胞系培养液中加入20 mmol/L葡萄糖后，细胞内UCP2蛋白浓度较含2 mmol/L葡萄糖培养液时升高4～5倍［18］。在高糖、高脂环境下，UCP2基因的转录可在过氧化物酶增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptors，PPARs)、固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)、肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor，HNF)等转录因子的作用下上调［19］。而Sirt1、插头框转录因子A1(FOXA1)及白介素-1β可以下调 UCP2 基因的表达［19－20］。UCP2 mRNA 的翻译过程受其基因上游抑制性开放阅读框的调控，当该开放阅读框发生突变时，UCP2 mRNA翻译为蛋白的能力大为提高［21］。谷氨酰胺可以抑制该开放阅读框的作用，增加UCP2 mRNA翻译为蛋白的水平［16］。体外研究发现，ROS及其氧化还原级联反应下游衍生物(如活性链烯类物质HNE)增大线粒体ΔΨm可以上调 UCP2的表达［22］。HNE除上调UCP2浓度外［23］，还可激活离体线粒体中UCP2蛋白的催化活性，即启动UCP2蛋白将质子转运至线粒体内膜内［24］。Brand 等［10－11］对这种现象提出了一种假设:线粒体ΔΨm增加时，线粒体电子传递链中各复合物更易处于还原状态，将单电子传递给氧生成ROS，在线粒体内膜层经历氧化还原级联反应生成脂肪酸过氧化物，最终生成HNE，HNE通过某种机制(如HNE解除GDP对UCP2的抑制作用或与GDP竞争结合UCP2或与UCP2分子基团相互作用等，目前仍不明确)开放UCP2通道，降低线粒体ΔΨm，这一过程可以通过负反馈的作用降低ROS的产生，发挥抗氧化应激保护作用。而嘌呤核苷酸如ATP、GDP 及白介素-1β 则可抑制 UCP2 活性［24］。UCP2蛋白在细胞内的半衰期很短，约1 h，可能与泛醌介导的蛋白酶体降解作用有关［13］。

UCP2与胰岛β细胞功能 UCP2的生理功能及其在β细胞中的作用目前仍没有得到完全阐明，但逐步积累的研究证据提示，UCP2可能从3方面参与胰岛β细胞功能的调控:(1)UCP2轻度的解耦联作用降低线粒体ΔΨm，这种解耦联作用的即刻效应使能量分子ATP生成减少，降低了β细胞内ATP/ADP比值，从而抑制了胰岛β细胞GSIS能力［7］;(2)UCP2的解耦联效应可以降低高糖、高脂环境下线粒体内ROS水平，具有抗氧化应激的细胞保护作用［8］;(3)ROS在胰岛β细胞中不仅是毒性分子的角色，适量的ROS水平充当着β细胞GSIS的信号分子;(4)UCP2的解耦联作用可影响β细胞内ROS水平，调控β细胞 GSIS 能力［9］。

UCP2对胰岛β细胞GSIS的直接作用 在β细胞GSIS的经典模式中，葡萄糖在线粒体中代谢生成ATP，升高ATP/ADP比值，抑制KATP通道，致使细胞膜去极化，开放电压门控Ca2+通道，使细胞内Ca2+升高，从而刺激胰岛素释放至细胞外。任何介导线粒体跨膜质子内流的过程将降低线粒体ΔΨm、线粒体氧化磷酸化效能、ATP/ADP比值及β细胞GSIS能力，因此UCP2被认为是β细胞GSIS的一个负性调控因子。离体的胰岛β细胞系或胰岛成为观察UCP2对β细胞GSIS功能影响的直观模型，上述观点在一系列体外试验中得到支持:如Chan等［17］最早证实在大鼠胰岛中利用腺病毒载体过表达UCP2基因后，尽管胰岛内总的胰岛素含量不变，但其GSIS能力严重受挫。且过表达UCP2基因的胰岛并不能抑制给予钙离子通道载体所诱导的胰岛素分泌，表明UCP2对GSIS信号通路的作用部位位于钙离子的上游［17］。Hong等［25］在胰岛 β 细胞-1E细胞中亦发现过表达UCP2抑制β细胞的GSIS能力;而Affourtit等［14］利用 RNA干扰技术在 INS-1E细胞系内短期抑制UCP2基因表达可迅速提高该β细胞的GSIS能力;Genipin是研究者从中药栀子花中提取的可在线粒体水平上抑制UCP2介导的质子漏而不影响线粒体其他功能的一种化合物，在ob/ob大鼠分离的胰岛中给予Genipin后可以逆转肥胖及高糖所诱导的β细胞功能障碍［26］。也有研究者得到不同的观察结果:Wang等［27］观察到在ZDF糖尿病大鼠胰岛中过表达UCP2基因可以改善β细胞功能。Produit-Zengaffinen等［28］研究发现，过表达UCP2基因的INS-1E细胞系的GSIS功能虽然有轻微的抑制，但与对照组并没有显著性的差异。在前者，ZDF糖尿病大鼠本身胰岛β细胞可能存在线粒体能量代谢功能障碍;在未过表达UCP2基因前，肥胖的 ZDF大鼠胰岛与对照的 Zucker大鼠相比，UCP2蛋白水平降低，因此过表达UCP2基因后可能反而可将其线粒体膜功能恢复到接近生理状态，从而观察到改善的 GSIS能力。而在 Produit-Zengaffinen等［28］的研究中，INS-1E 细胞系过表达UCP2的水平没有既往的研究高，可能是其没有观察效果的原因之一。

UCP2对β细胞线粒体内ROS水平的调控由于ROS对β细胞的功能和生存具有关键的影响，因此UCP2解耦联效应对β细胞线粒体内ROS水平的改变和由此产生的对β细胞功能的影响也受到广泛关注。

线粒体ROS的产量极其敏感地依赖于线粒体ΔΨm，因此研究者们推测，UCP2轻度的解偶联作用可减少线粒体ROS生成，预防氧化应激损伤。1997年，Nègre-Salvayre等［29］首先证实了以线粒体解偶联抑制剂GDP抑制胰腺及胸腺线粒体中UCP2的表达可导致线粒体ΔΨm增加及线粒体来源的ROS生成增加，揭示了UCP2的线粒体解偶联作用与ROS生成的关系。继而有多项研究证实在多种细胞中，包括神经元细胞、肝细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、内皮细胞等，使UCP2基因表达上调可减少ROS的氧化应激损伤:如使脑部UCP2基因表达增加，可抑制缺血所致的ROS脑损伤、抑制神经元细胞的凋亡［30］;过度表达 UCP2的 HepG2肝细胞内 ROS水平降低，继而由氧化应激损伤所致的肝细胞凋亡减少［31］。在3T3-L1脂肪细胞或巨噬细胞中过表达UCP2，抑制细胞内 ROS 的生成［32－33］;特别在内皮细胞中，AMP激活的蛋白酶可通过上调内皮细胞UCP2的表达，从而抑制棕榈酸盐诱导的ROS生成增加［34］。UCP2表达上调使ROS生成减少，增加内皮细胞NO合成，改善内皮依赖的舒张功能［35］。此外，UCP2抑制ROS生成的抗氧化应激作用具有改善动脉粥样硬化的效应:如将UCP2基因敲除的小鼠骨髓移植入LDL受体基因敲除的小鼠体内，可导致氧化应激、动脉局部巨噬细胞的聚集、凋亡增加、胶原成分减少，斑块局部硝基酪氨酸染色增强，更易发生动脉粥样硬化［36］。慢性高糖、高脂环境下，过量的ROS对β细胞造成损伤，包括对β细胞合成、释放胰岛素、GSIS、线粒体能量代谢、形态及β细胞凋亡产生不良影响［3－6］。而在β细胞和胰岛中，也观察到了UCP2的抗氧化应激作用:通过UCP2基因敲除抑制胰岛UCP2的活性后，线粒体ΔΨm增加、胰岛过氧化物生成增加、ATP水平升高［37］。UCP2抑制炎症因子对β细胞内过氧化物生成的诱导:在INS-1E中过表达UCP2可以抑制细胞因子如白介素 1-β 诱导的 ROS 的产生［28］。在 Pi等［38］报道的UCP2－/－小鼠胰岛中，还原型谷胱甘肽(GSH)减少、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和硝基酪氨酸增加，支持UCP2基因缺失后胰岛局部氧化应激增加，UCP2在胰岛β细胞具有抑制氧化应激的作用。以上证据表明，UCP2在多种细胞(包括β细胞)中可降低过氧化物水平，从而具有抗氧化应激损伤的作用。

现有研究发现［8］，在β细胞中葡萄糖代谢、氧化磷酸化过程中产生一定浓度范围内的ROS，特别是过氧化氢(H2O2)，是β细胞GSIS的信号分子，对β细胞功能具有促进作用。H2O2具有信号分子的一些特性:分子量小、稳定、不带电荷、可自由弥散，合成和降解过程迅速。在胰岛β细胞中，多个与GSIS相关的信号转导分子和过程可能受H2O2调控:包括Ca2+依赖的蛋白激酶、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)、电压门控K+通道、Ca2+的内流和释放、c-Jun N末端激酶(JNK)、NF-KB、SIRT1脱乙酰基酶等［4］。尽管H2O2如何通过上述多种靶点分子调控β细胞GSIS仍不明确，但已有多位学者在他们的研究中证实H2O2可以刺激β细胞释放胰岛素。Collins等［31］研究发现:短暂升高细胞内H2O2浓度可增加β细胞胰岛素分泌，给予抗氧化剂抑制葡萄糖代谢过程产生的H2O2可以损伤β细胞的GSIS功能。Leloup等［2］也证实线粒体来源的ROS是β细胞GSIS的必需信号分子。将β细胞短期暴露于浓度逐步升高的葡萄糖环境下，其胰岛素释放增加。此过程中不同浓度的葡萄糖代谢后致β细胞内ATP/ADP比值发生改变的不同，无疑是调控β细胞胰岛素释放量的最强因素，但值得注意的是，ROS的生成也与该过程紧密相伴，且不是简单的伴随状态。Collins等［31］及Leloup等［2］的研究表明，H2O2是继 ATP后在 β 细胞内将葡萄糖水平耦联至胰岛素分泌的信号分子。那么UCP2对线粒体ROS水平的调控作用，是否会影响β细胞GSIS能力?最近Brand等［10－11］观察到:在 INS-1E 细胞系中急性抑制UCP2后，β细胞GSIS能力增强，但给予抗氧化剂后此效应减弱。此实验结果表明:UCP2对β细胞GSIS的调控不仅限于ATP/ADP比值的改变，其对β细胞线粒体内ROS水平的调控，是影响β细胞GSIS作用的重要途径。

UCP2对β细胞功能影响的体内研究 UCP2对β细胞功能的影响比较复杂，它的解耦联作用可直接抑制β细胞GSIS能力，又可以保护高糖、高脂环境下β细胞免于氧化应激损伤。通过体内研究观察抑制或上调UCP2对β细胞功能的长期综合效应或许是较佳的模型，但目前的体内研究没有得到统一的结果。最早 Zhang等［39］通过构建UCP2基因敲除(UCP2－/－)小鼠发现UCP2基因敲除后小鼠具有增强的GSIS能力;他们进一步在ob/ob糖尿病小鼠中敲除UCP2基因，观察到ob/ob小鼠的血糖水平得到改善，血胰岛素水平升高，葡萄糖耐量试验中ob/ob糖尿病小鼠的1相胰岛素分泌能力得到恢复。之后有研究者发现［7］，通过腹腔注射的方式，短期给予Swiss大鼠和ob/ob鼠UCP2反义寡核苷酸后，可改善大鼠的血糖水平、提高血胰岛素浓度，使分离胰岛内的ATP含量增加、GSIS能力增强。但Produit-Zengaffinen等［28］的研究结果并不支持UCP2在体内对β细胞功能具有显著的调控作用，在β细胞特异性过表达UCP2的转基因小鼠中，血浆葡萄糖及胰岛素水平没有发生显著变化，小鼠的糖耐量及GSIS能力亦没有减退。Pi等［8］构造的 UCP2－/－小鼠模型甚至表现出降低的GSIS能力。在他们的UCP2－/－小鼠模型中，小鼠胰岛在3 mmol/L葡萄糖环境下H2O2水平即明显升高，16．7 mmol/L葡萄糖浓度培养时，H2O2的净增长减少。推测3 mmol/L葡萄糖浓度环境下，过高的H2O2水平使抗氧化酶水平代偿性上调，干扰了生理情况下H2O2的信使作用，导致胰岛β细胞GSIS能力减退。UCP2－/－小鼠的不一致表型可能与构建模型时被敲除的UCP2基因附近的遗传背景干扰相关［8］。其次对UCP2－/－小鼠β细胞功能变化的解释需谨慎，因为在UCP2整体敲除之后，其体内其他组织、器官、细胞，如巨噬细胞、脂肪组织、神经元细胞(分泌POMC的神经元)内UCP2基因缺失后对胰岛β细胞功能可产生间接影响。此外，在解释糖尿病动物模型的UCP2干预结果时，需考虑不同动物模型的发病机制特点，不同模型的发病过程中UCP2的病理生理作用可能有所不同。摒除混杂因素，构建更为精确的模型，才能进一步明确UCP2在体内对β细胞功能的精细调控作用。

结语 UCP2的解耦联作用可改变β细胞线粒体ΔΨm，从而影响β细胞功能。它是β细胞感受葡萄糖水平到分泌胰岛素过程中的重要调节因子，但这种调控作用精细复杂，涉及多个分子和多条途径，目前有一定的认识，尚未完全明确，因此不能简单的将UCP2对β细胞的作用归类为抑制或保护。构建更为精确的体内、外模型，探讨UCP2在生理或病理情况下对β细胞内能量代谢、ROS水平、GSIS的调控作用及机制是进一步探索的方向，其研究结果可以帮助深入理解β细胞功能障碍、2型糖尿病发生、发展的病理生理机制，提供新的治疗靶点。

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