新一代遗传标记——InDel研究进展

孙 宽 ，张素华 ，朱如心 ，赵书民 ，李成涛

（1.复旦大学上海医学院法医学系，上海 200032；2.司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室，上海 200063）

亲权鉴定和个体识别是法医DNA鉴定的主要内容。 短串联重复序列（short tandem repeat，STR）分型技术是目前普遍采用的技术手段[1-2]。STR基因座是核心序列为2～6 bp的短串联重复多态性遗传标记。20世纪90年代初，STR基因座首次作为一种重要的遗传标记在人类亲权鉴定中被使用[3-4]。从此，法医物证鉴定进入了DNA鉴定时代。随着STR基因座在法医DNA分析中的广泛应用，其缺陷也日益受到关注，如STR基因座的高突变率[5-8]不利于亲权鉴定的结果解释，PCR扩增子较长不易实现对降解检材的DNA分型，STR基因座的数量有限不利于复杂亲缘关系的鉴定等。而曾被学界提出有望作为STR替代标记的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）则因受到分型系统的限制而止步于更广泛的法医DNA鉴定的应用，因此，寻求新的适用于法医DNA分析的遗传标记已经成为研究的重点之一。本文通过总结与回顾近年来的研究成果，对一种新型的遗传标记——插入/缺失（Insertion/Deletion，InDel）多态性遗传标记的研究进展、应用现状进行综述。

1 新型遗传标记在法医DNA分型中的应用

目前而言，STR分型仍被认为是法医DNA鉴定中最标准、最权威的途径和方法，能够解决大多数的实际问题[6，9]。然而基于STR遗传标记在法医DNA分型中存在的上述缺陷，国内外的学者均在探索寻找新的遗传标记以克服STR遗传标记的缺陷。

SNP作为第三代遗传标记，被认为是STR潜在的理想替代者之一[10]。作为STR的替代性标记，SNP在亲权鉴定和处理高度降解样本等一些特殊的案件中具有更高的应用价值。据估计，SNP的突变率约为1×10-8[11-12]，而 STR 则约为 2×10-3[5-8]。 并且，采用 SNP 也有利于降解检材的分型[13]。基于SNP的上述优势，国内外众多学者在SNP的法医学应用研究方面开展了大量的工作，建立了很多基于不同技术平台的SNP分型方法如TaqMan探针的 SNP分型方法[14]、Minisequencing原理的方法[15-16]、熔解曲线方法[17]、MALDITOF质谱分析法[18-19]、芯片杂交[20]等。现有SNP分型方法的多样性也体现出了其在法医学应用方面所面临的困境之一，即其分型方法难以做到类似STR基因座这样的分型平台的统一化，由此在一定程度上也限制了其在法医学鉴定实践中的推广应用。

2 InDel多态性遗传标记在法医DNA分型中的研究进展

2.1 InDel概述

InDel多态性是人类基因组中一种特殊类型的二等位基因遗传标记，表现为基因组中插入或缺失了不同大小的小片段DNA[21]。InDel大致分成以下5大类：（1）单碱基对的插入/缺失；（2）单一碱基的插入/缺失；（3）重复单元为2～15碱基的多碱基对插入/缺失；（4）转座子插入/缺失；（5）任意 DNA 序列的插入/缺失多态性[22]。在法医DNA鉴定中被选作鉴定用遗传标记的InDel通常是第3种。

InDel作为新一代的法医遗传学鉴定标记，兼具STR和SNP的优点。与STR相比，InDel本质上属于长度多态性，可以应用于目前法医DNA实验室普及的毛细管电泳技术平台上进行分析，分型技术易于掌握和普及[21-23]；与SNP相比，均是源自于单突变事件，其突变频率较低，约为10-8，比STR小几个数量级，相对比较稳定；在结构上属于二等位基因多态性，等位基因都固定并且已知，能够通过很小的扩增子进行扩增（＜50bp），提高了扩增高度降解DNA的成功率。

作为一种重要的遗传标记，InDel的研究最早并非聚焦于法医遗传学的应用，而是在分子生物学及生物医学领域。遍布于整个基因组的InDel频率仅次于SNP位居第二，其中约三分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域如启动子区和外显子区[24]。分子生物学家最早就是将其用于基因表型相关的研究，希望通过将人类性状、疾病症状或是易感性进行联系，从而达到基因诊断与治疗的目的。2005年，Bhangale等[24]报道了一种能够从目的基因中全面识别InDel变异的方法，并应用该方法从330个备选基因中找到了2 393个InDel变异位点，得出人类基因组中缺失多态性出现的频率高于插入多态性的结论，同时提出，InDel和SNP的形成机制可能不同，但其进化历史是相似的。然而，相关的后续报道并不是很多，甚至在近几年有递减趋势，究其原因主要有以下 3 点[25]：（1）分型方法没有定论；（2）位点间的位置排列对其生物学作用有一定影响；（3）其变异的内部机制不清。其中最关键的问题是插入变异与缺失变异是否通过相同的途径产生。Sjödin等[25]已经找到相关证据表明插入变异与缺失变异均与点突变相关，其中插入变异与缺失变异的比值决定于其所在的基因组的特征；与插入变异相比，缺失变异的毒害性似乎更强一些，但在其他方面，缺失变异与插入变异基本受控于相同的基因因素。他们也对黑猩猩的基因组进行扫描，发现人类内部缺失变异与插入变异比值的差别比人类与黑猩猩间的差别更大，这与之后Bastos-Rodrigues等[26]对人类基因组多样性计划-人类多态性研究中心（Human Genome Diversity Projectthe Centre d’Étude du Polymorphisme Humain，HGDPCEPH）的多样性分析结果相一致。

2006年，Mills等[22]创建了第一个人类基因组In-Del图谱。该图谱中包含有415000多个具有特异性的多态性位点，平均密度为每7.2kb一个InDel位点。2011年的随访研究[27]又报道了在79种不同人群的基因组中发现了近200万个小InDel多态性标记，其长度从1bp到10000bp不等。这些小InDel中，约41%是随机的DNA序列，其等位基因长度也在较大的范围内发生变异，但大部分还是集中于100 bp以下[22]。这项工作被认为是InDel位点识别方面里程碑式的进展，大大促进了InDel在相关领域的研究，同时也引起了法医学领域的关注。

2.2 InDel在法医DNA分析中的应用

2.2.1 常染色体InDel

对于法医DNA分型而言，主要所关注的是非编码区的InDel信息对于个体识别与亲权关系鉴定的作用，因此，上述在生物医学领域研究中存在的弊端[25]并不影响InDel在法医学领域中作为新一代遗传标记的重大贡献。

Rosenberg等[28]于 2002年采用 STR对 HGDPCEPH多样性体系进行了研究，从基因角度与地理角度的分类得到了相同的结论，将世界人群分为五类：美洲人群、撒哈拉以南的非洲人群、东亚人群、大洋洲人群及欧洲、中东和中亚的混合人群。2006年，Bastos-Rodrigues等[26]利用40个小片段InDel位点作为遗传标记（包含来自于52个人群的1064个个体）的对世界人群HGDP-CEPH多样性进行研究，用以排除种族、地理、文化、宗教、长相等其他因素对于人群中遗传多样性的影响，结果表明，人群中个体间差异（85.7%）与人群间的差异（12.1%）并没有之前报道所描述的那样悬殊。据分析，该结论与之前用Alu和SNP作为遗传标记得到的结论更为接近[29-31]。并证实用来进行群体遗传学研究的这40个InDel位点作为遗传标记的效率等同于65个Alu或60个SNP。

2009年，Pereira等[32]建立了一种用于人类个体识别的多重PCR体系，该体系包含有38个小片段（2～5bp）非编码二等位基因的常染色体InDel。其优势在于能够通过一次PCR得到所有目标产物，产物通过标准的毛细管电泳平台进行检测分型。在这些位点中，最长的扩增子长度为160bp，能够对于标准STR分型无法进行完整分析的降解样本进行成功分型。此外，他们对包括安哥拉、莫桑比克、葡萄牙、澳门以及台湾等地区的306个个体进行群体遗传学调查，所有的InDel位点均呈现出较好的多态性，随机匹配概率在10-15～10-14，是进行人类个体识别研究的有效手段。随后，他们还对这个包含有38个InDel位点的分型系统在实际检案工作中的应用进行了后续的验证实验[33]，尤其是对高度降解DNA样本的鉴定与作为亲权关系鉴定辅助性工具的可行性进行了讨论。他们以骨骼提取物作为高度降解DNA检材的来源，对这个InDel分型系统进行测试，并将分型结果与传统的STR分型结果进行比对，电泳结果显示除了个别位点的不平衡分型外，InDel分型系统明显优于传统的STR分型系统。

2010年，Pimenta等[34]则专门为亲权关系鉴定设计了一个包含有40个InDel位点的多重扩增体系，该体系所收录的位点广泛分布于各条常染色体，并且在欧洲人群中的等位基因频率基本都接近于0.5。该研究对360个巴西无关个体进行分型并在50组母-子-可疑父三联体样本中进行了验证，40个InDel位点的平均杂合度达到0.48，随机匹配概率达到3.48×10-17，累积非父排除率为0.9997。其法医学参数效能与13个CODIS STR基因座相当[1]，具有良好的亲权鉴定能力。

2011年，针对中国汉族人群的基因组特征，Li等[35]建立了一套包含有29个InDel位点的用于人类个体识别的多重PCR体系。该研究从dbSNP数据库中选取了互不连锁的29个InDel位点，并采用SNPlex分型系统在109个上海无关个体中进行了等位基因频率及法医学参数调查，为中国人群的InDel多态性研究提供了宝贵的数据。随后，Li等[36]又建立了一个综合性更强、适用性更广的包含有30个InDel位点的多重PCR扩增体系，该体系适用于中国五大主要民族：汉族、回族、维吾尔族、蒙古族和藏族。群体遗传学结果显示，这30个位点的等位基因频率在五大民族中均符合遗传平衡，并且不存在任何连锁不平衡的状况，杂合度均在0.46以上，累积个体识别效能在5个民族中均大于0.99999999999，表明该系统对于中国这5个主要民族，无论是进行亲权鉴定或是个体识别均具有一定的鉴定水准，其系统CDP值接近于12个常用的STR基因座。虽然要达到现有商业STR分型试剂盒的效能还需要增加更多的位点，但这对InDel这种遗传标记在中国这样一个多民族大国的应用提供了实验基础及研究思路。同年，Zhao等[37]采用Li等[35]建立的InDel分型系统对极有可能涉及突变的特殊样本肿瘤来源检材进行了实验验证。他们对100例胃肠肿瘤样本及其同源正常组织样本分别进行STR分型和InDel分型分析，与同源正常组织DNA相比，胃肠肿瘤组织DNA体现出2种InDel突变（部分杂合性丢失和完全杂合性丢失）和4种STR突变类型（部分杂合性丢失、完全杂合性丢失、新等位基因和额外的等位基因），其中InDel分型的变异频率是STR分型变异频率的1/21。从而证明了InDel的稳定性更高，为肿瘤组织这样的特殊检材的正确分型提供了更为可靠的保障。

2012年，Manta等[38]对InDel分型体系在巴西司法鉴定案件（个体识别和亲权关系鉴定）中应用的有效性进行了评估验证。结果表明，该研究建立的38个InDel位点在实验人群中的多态性表现良好，能够达到作为该地区司法鉴定案件中遗传标记的标准，同时进行的尸体样本分型也都得到了阳性结果，证实了InDel这种具有短扩增子的二等位基因遗传标记作为STR分析降解DNA样本辅助性工具的可能性与有效性。

2.2.2 X染色体InDel

继常染色体基因组之后，InDel在X染色体上的研究逐渐受到关注。自2009年以来，陆续有研究团队报道相关研究成果。对于X染色体，最直观的就是男女两性间的差别。由于男性携带的是单倍型的X染色体，有效群体量被缩小，遗传漂变的可能性增大，人群间差异的敏感度也随之提高[39]。因而，X染色体上的遗传标记更能够准确地反映人群变化的历史及人类进化学的问题。而X染色体在代系间特殊的传递方式，使其表达的信息也有别于常染色体、Y染色体以及mtDNA，由于重组的发生，X染色体的不同区域能表现出不同的信息，即所携带的信息具有区域性[40]。与常染色体相比，X染色体的低重组率造成了位于其上的位点间连锁不平衡概率的增大，相关参数的计算则需要采用单倍型的策略。也正因为如此，X染色体成为了解决一些特殊案件的唯一途径，例如人群发展过程中两性的迁移问题或者是两性之间遗传与重组模式的差异问题[40-41]。

在一些缺乏相关信息的特殊亲权鉴定案件中，X染色体可能比常染色体表现出更高的鉴定效能[42-44]。鉴于此，X染色体上的各种多态性标记，包括X-STR、X-SNP，以及近段时间的X-InDel已被广泛应用于调查人群的遗传结构，评估混合人群中各血统的比例以及用于亲权关系鉴定和个体识别案件[42，45-51]。

Ribeiro-Rodrigues等[45]于2009年建立了一个包含有13个X染色体InDel位点的多重扩增体系，用于评估由非洲、欧洲以及美洲土著血统组成的混合人群中各血统人群的比例。结果表明，以X-InDel作为遗传标记得到的比例信息与mtDNA以及Y染色体提供的信息相吻合[41，51]。 Edelmann等[46]建立了一个包含有26个X-InDel位点的多重扩增体系，用于亲权鉴定和个体识别。该研究从100组已证实的具有亲子关系的家庭中选取女儿作为频率及突变率调查对象进行群体遗传学调查，结果表明，该X-InDel分型系统有望成为未来法医遗传学研究的重要工具。随后，Freitas等[49]开发了一个包含有33个X-InDel位点的分型系统（其中13个与Ribeiro-Rodrigues等[45]开发的位点相同），用以检测其在法医DNA分型实践中的可行性和在复杂亲权关系调查案件中作为补充分析工具的有效性。结果表明，该系统的分析结果与之前在其他人群中采用的X-STR分析得到的数据相吻合[52]，考虑到STR的高突变性，InDel位点作为遗传标记或许更适用于某些相关鉴定。Pereira等[53]于2012年也建立了一个包括32个InDel位点的多重扩增体系，这些位点均在非洲、欧洲和亚洲3种主要人群中表现出较高的多态性，平均非父排除率在二联体中为 0.9980～0.9996、三联体中为 0.99997～0.999998。

2.3 InDel在法医人类学中的应用

InDel作为法医人类学研究中的重要遗传标记也得到了越来越多的关注。巴西人是世界上异质性最强的人群之一，是美洲土著、欧洲（主要是葡萄牙）和非洲三大血统的混合体。在不同的地理区域，混合的过程也是不完全一样的，史料记载，美洲土著人主要定居在北部，东北部主要是非洲血统的，而在南部这两种血统则占有较小比例。准确区分不同血统在混合人群中的比例是回答人类进化相关科学问题的基础，也为评价人群亚结构奠定了坚实的基础[54]。因此，InDel在群体遗传学及人群结构学中的应用主要体现在对巴西混合人群的研究上。Santos等[55]利用48个InDel位点作为始祖多态位点（ancestry informative marker，AIM），即在不同地理起源的人群中等位基因频率存在显著性差异的遗传标记，用来评价人群混合程度及确定人群结构，在混合人群中区分不同血统的人种。为了能够在具有不同血统的混合人群中有效地衡量各血统来源的个体的比例，他们选取了48个具有较高血统信息量的InDel位点，与2006年采用40个InDel位点确定人群基因亚结构的Bastos-Rodrigues等[26]不同，该研究所选的48个InDel位点具备丰富的血统信息而不仅是在欧洲人群中具有较高的杂合度。将该体系在593个无关个体中进行群体调查，并在380个来自于已知是混合人群的巴西人群中进行验证，分析结果与预期相符。这样一个由48个InDel位点组成的AIM体系能够用来区别不同大陆的人种，特别是欧洲、非洲和美洲土著人群，在混合人群中能够有效识别遗传亚结构，对于群体遗传学的研究和案例对照相关研究中人群亚结构的识别都具有推动性意义，更为现实的是为巴西这样一个人群组成复杂的地域人种的区分提供了可行性方案。总之，与血统信息密切相关的InDel是进行混合人群血统成分分析的最佳工具，能够在混合人群中准确推断血统来源及比例的能力，使其成为人群亚结构相关研究特别是巴西及其他由于历史原因而造成人群来源比较复杂的拉丁美洲地区人群研究的利器。

Pena等[56]用一个含有40个InDel位点的体系[26]对934个来自巴西的混合人群进行分型调查，以确认巴西地区的人群在临床及药物方面是否与社会学中种族调查所报道的异质性那样强。他们发现，被调查者所声称的白种、黄种或是黑种人很大程度上是语义学上的定义，而非真正的遗传因素造成的。为避免主观上的所谓地域差异，他们将不同地域人群混合后随机取样分型，而不考虑关于人种的声明。将某种颜色的人群中某个血统人群所占的比例与某特定区域内官方统计的这种颜色人种的比例相乘，得到“总血统”估计。这样，得到的人群统一度比之前预期的要高很多，也就是说该地区人群在临床及药物等方面的异质性并不像之前估计的那么高。在所有区域中，欧洲血统占主导，在东北部占60.6%，在南部占77.7%。由此得出结论，19世纪到20世纪期间600万欧洲人向巴西移民——被称作“巴西白色化”——很大程度上改变了之前不同血统人群严格按地域划分的局面。

3 小 结

综上，InDel作为新一代的遗传标记表现出其在法医遗传学分析及人群遗传学领域得天独厚的优势，越来越多的学者将目光聚焦于此。当然，InDel位点也存在一些二等位基因遗传标记所具有的不足，主要表现在两方面，一是InDel所携带的遗传信息有限，要达到足够高的分辨效能，需要联合更多的InDel位点，而将大量的位点集中在同一多重扩增体系中增加了技术上的困难；二是InDel位点在不同人群中的分布也表现出类似STR的人群差异，因此要真正应用于法医DNA鉴定实践，还需要更多的群体遗传学数据作支撑。但是与这些不足相比，InDel兼具有STR和SNP的优点，能够依托现有的毛细管电泳技术平台，在法医DNA分析中必将得到进一步的广泛应用。

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