肌成纤维细胞的研究进展及其法医学应用

于天水 ，凌 跃 ，官大威

（1.中国政法大学 证据科学教育部重点实验室，北京 100040；2.中国医科大学法医学院，辽宁 沈阳 110001；3.南通市公安局崇川分局，江苏 南通 226006）

肌成纤维细胞（myofibroblast）是一种表达平滑肌肌动蛋白的高度分化型细胞。肌成纤维细胞参与纤维化级联反应中纤维形成和细胞外基质重塑两个阶段，因而在组织损伤修复中发挥了重要的作用。这一特性有望在皮肤损伤时间推断中得到应用。本文就肌成纤维细胞的形态学特征、生物学特性及其法医学意义进行阐述。

1 肌成纤维细胞的形态学特征

上世纪七十年代，Gabbiani等[1-2]通过电子显微镜技术首先对肉芽组织中的肌成纤维细胞进行了描述。随着对肌成纤维细胞的逐渐了解与认识，Sappino等[3]发现，肌成纤维细胞同时具有平滑肌细胞和成纤维细胞双重特性，存在于多种正常或病理组织中，且具有相似的形态学特征。

1.1 组织学特征

肌成纤维细胞通常为梭形或者星形，具有嗜酸性或者嗜双色性。细胞核常呈锯齿状、凝缩，染色质呈颗粒状，散在分布，核仁明显。

1.2 超微结构特征

肌成纤维细胞主要有3个超微结构特征：（1）应力纤维（stress fibers）。在细胞膜下沿细胞长轴平行排列的束状肌动蛋白微丝束，由β-/γ-肌动蛋白或α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）组成[4]。（2）纤维连接复合体。细胞内表面所形成的超成熟黏着斑，直径为 8～30μm，由黏着斑蛋白（vinculin）、桩蛋白（paxillin）、张力蛋白（tensin）以及 αvβ3、α5β1整合素构成，为肌成纤维细胞特有结构。细胞内的肌动蛋白微丝通过该特殊结构与细胞外的纤维连接蛋白（fibronectin）相连接[5]。 （3）细胞连接。 如缝隙连接等[6]。

1.3 特殊染色鉴别

通常情况下，通过常规HE染色较难将肌成纤维细胞与其他种类的成纤维样细胞（fibroblastic cell，FBC）相鉴别。2002年 Tomasek等[7]提出，α-SMA 免疫组织化学染色是鉴定肌成纤维细胞最可靠的特异性指标。从此，α-SMA免疫组织化学染色成为鉴定肌成纤维细胞常规以及普遍认可的形态学方法，阳性染色位于细胞质内。如果应用荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜进行观察，阳性信号于细胞质内呈细丝状排列。

2 肌成纤维细胞的生物学特性

在不同器官中，多种类型细胞在多因素作用下可以分化为肌成纤维细胞。正常情况下，肌成纤维细胞最后主要以凋亡的方式逐渐消失，不能继续分化，是一种终末型细胞。

2.1 肌成纤维细胞的来源、分化和调节

2.1.1 成纤维细胞分化为肌成纤维细胞

目前研究[7]表明，在皮肤、肺和肾等多器官损伤修复的纤维化发展阶段，部分肌成纤维细胞来源于成纤维细胞。成纤维细胞通过两个过程才能分化为肌成纤维细胞。第一，当损伤后结缔组织所承受的机械性张力（mechanical tension）或者炎症反应引起结缔组织微环境改变时，损伤周边区局部聚集的成纤维细胞会转化为原始肌成纤维细胞（proto-myofibroblast）。原始肌成纤维细胞内出现成熟黏着斑和由β-/γ-肌动蛋白所构成的应力纤维（stress fiber）。第二，在机械性张力、细胞因子和细胞外基质共同作用下，细胞内成熟黏着斑分化为黏着斑，接着α-SMA黏集到应力纤维上，导致原始肌成纤维细胞最终转变为分化型肌成纤维细胞（differentiated myofibroblast）。此外还表达其他一些平滑肌分化的标记物，如结蛋白（desmin）等。

上述过程表明，由于肌成纤维细胞主要来源于成纤维细胞，故机械性张力、细胞因子和细胞外基质3个因素共同影响着肌成纤维细胞的分化。

2.1.2 循环纤维细胞分化为肌成纤维细胞

1994年Bucala等[8]发现一类具有成纤维细胞特性的白细胞亚群，称之为循环纤维细胞（circulating fibrocytes）。它们是骨髓来源的间充质前体细胞，约占外周血白细胞的0.1%～0.5%。在体外，循环纤维细胞可以通过血液中单核细胞的培养获得，既表达造血细胞表面抗原CD34，白细胞共同抗原CD45，单核细胞系标记物 CD11、CD13、CD32和 CD64，又分泌细胞外基质（extracellular matrix，ECM），如Ⅰ、Ⅲ型胶原，纤维连接蛋白和波形蛋白（vimentin）。

越来越多的证据显示，在损伤愈合期间或在一些纤维化损害中，循环纤维细胞可以出现在纤维灶的周围，并且转化为肌成纤维细胞。定位于过敏性哮喘患者支气管黏膜胶原沉积区域的肌成纤维细胞可能来源于循环纤维细胞，研究人员[9]进一步对荧光标记的循环纤维细胞在过敏性哮喘小鼠中进行追踪研究，间接证实了上述结果。

2.1.3 上皮细胞分化为肌成纤维细胞

在一些情况下，上皮细胞会失去极性和细胞连接，并且经历细胞骨架重塑，不表达其特异性标志物E-钙粘素（E-cadherin）和紧密连接蛋白-1（zonula occluden-1），而表达间质细胞标志物成纤维细胞特异性蛋白1和α-SMA，即上皮-间质转变（epithelialmesenchymal transition，EMT）。

有学者研究[10-12]肾小管上皮细胞系和肾纤维化模型发现，TGF-β、高级糖基化终末产物以及CTGF参与调节上皮细胞向肌成纤维细胞转化的过程。另外，对特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的肺泡上皮细胞进行原代培养和TGF-β1（100pmol/L）长时间作用后，肺泡上皮细胞会出现成纤维样细胞的形态，并且α-SMA、Ⅰ型胶原、波形蛋白和结蛋白表达增加，上皮细胞标志物表达减少。IPF患者肺组织标本中肺泡上皮细胞共表达上皮细胞标志物和α-SMA，所以IPF中的肌成纤维细胞可能来源于上皮细胞[13]。实验性小鼠肺纤维化动物模型进一步确定EMT存在于体内，参与了纤维形成[14]。

2.2 肌成纤维细胞在损伤修复中的作用

2.2.1 收缩功能

肌成纤维细胞能够收缩是因为表达具有收缩性质的α-SMA，并且超成熟黏着斑大小直接影响肌成纤维细胞的收缩强度，每μm2产生6.6～12.6 nN的收缩力。肌成纤维细胞通过缝隙连接和超成熟黏着斑在细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间传递收缩力，诱导细胞外基质收缩和重塑，使整个收缩过程达到同步化[6]。在皮肤创伤愈合过程中，肌成纤维细胞出现在创面收缩阶段，减少创口组织的表面面积，有利于上皮再形成，以促进创口的愈合。另外，Gabbiani等[15]在掌筋膜挛缩综合征和足底筋膜挛缩综合征患者的病变腱膜组织中发现了具有收缩性质的肌成纤维细胞，其收缩功能对上述综合征的发病起到重要作用。

2.2.2 分泌功能

肌成纤维细胞具有发达的粗面内质网和高尔基体，为了代替坏死的组织，肌成纤维细胞分泌大量的细胞外基质，包括胶原纤维（Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ）、蛋白多糖、金属蛋白酶组织抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）、TIMP-2 等。 体外细胞培养发现，肌成纤维细胞和成纤维细胞一样可以分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原，其比例也基本是1∶1，但胶原合成量是成纤维细胞的3倍[16]。羊胚胎损伤愈合研究证实从孕早期（75d）到孕晚期（100d和 120 d）过程中，羊胚胎伤口中肌成纤维细胞从无到有，细胞数量逐渐增加，羊胚胎损伤修复的形式则从无瘢痕转变为瘢痕形成[17]。这些研究说明肌成纤维细胞通过分泌细胞外基质参与组织损伤修复和器官纤维化。

2.3 肌成纤维细胞的归宿

在正常损伤修复后期肉芽组织转变为瘢痕组织的过程中，肌成纤维细胞内编码凋亡蛋白的基因开始表达，是肌成纤维细胞最后消失的主要机制。有学者[4]发现大鼠皮肤损伤15d之后许多肌成纤维细胞发生凋亡，直至伤后30d消失。Desmoulière等[18]在大鼠皮肤损伤愈合过程中利用原位末端标记片段DNA方法检测肌成纤维细胞的凋亡率，发现伤后16 d凋亡细胞显著增加，伤后20d达到高峰，约9%～12%的细胞发生凋亡，到伤后60d则无阳性染色。电子显微镜结果显示，含有吞噬溶酶体的巨噬细胞位于凋亡细胞的周围，提示巨噬细胞的吞噬作用可能是清除凋亡小体的主要途径。但是引起肌成纤维细胞凋亡的原因目前还不十分清楚，可能与细胞外基质重塑时基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、MMP-2和TIMP等酶类含量变化有关[19]。Murphy等[20]进一步证实，TIMP-1灭活基质金属蛋白酶能够抑制肝肌成纤维细胞的凋亡。还有研究[21-22]表明，TGF-β1通过激活p38MAPK-PI3K-AKT信号通路和抑制IL-1-iNOS表达，从而阻止肌成纤维细胞凋亡，所以创面愈合后创口内TGF-β1的减少可能也是引起肌成纤维细胞凋亡的一个原因。

3 肌成纤维细胞的法医学意义

Darby等[4]通过电子显微镜技术和免疫组织化学方法研究α-SMA在大鼠开放性创伤愈合肉芽组织中的表达情况，证实从伤后6 d开始α-SMA阳性染色逐渐增强，15d达到高峰，此后表达减弱，至30d没有阳性表达。上述实验结果提示，肌成纤维细胞的出现具有一定的时间规律性，为其在法医学损伤时间推断方面的应用奠定了基础。Betz等[23]对人类皮肤损伤后存活不同时间的组织标本进行组织学和免疫组织化学检测，发现伤后5 d内典型肉芽组织尚未形成，肌成纤维细胞也未出现，但是从伤后5d至2个月的部分标本中可以找到肌成纤维细胞，所以在损伤皮肤中检测出α-SMA阳性的肌成纤维细胞，可以认定皮肤损伤时间大约5d以上。近年来国内也有关于肌成纤维细胞在皮肤损伤时间推断方面的研究报道。研究人员利用免疫组织化学染色方法观察小鼠皮肤切创后各个时间段α-SMA的表达情况，发现伤后1d α-SMA阳性细胞率开始增加，3 d阳性细胞率达高峰，伤后5～14 d阳性细胞率逐渐下降[24]。然而来源于循环纤维细胞的CD45+/α-SMA+肌成纤维细胞于伤后5d才开始出现在新生的肉芽组织中，并于伤后7d数量达到高峰[25]。国内研究的表达时间均比Darby等[4，23]研究结果有所提前，其原因可能是所选用的实验对象种属不同，小鼠损伤愈合过程要比大鼠和人类迅速；其次可能是由于免疫组织化学染色方法不同，前人多利用ABC法，而当今SP法和免疫荧光技术敏感性更高。

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