浙南地区女性人群CYP2D6及MDR1基因多态性对曲马多镇痛效果的影响

马光泛 陈千煌

浙南地区女性人群CYP2D6及MDR1基因多态性对曲马多镇痛效果的影响

马光泛 陈千煌

目的 探讨CYP2D6*10等位基因及MDR1 C3435T基因多态性对浙南地区女性人群术后曲马多镇痛效果的影响。方法 收集行子宫肌瘤剥除手术患者194例，手术结束前30 min肌肉注射曲马多，采用患者自控镇痛（PCA）模式进行术后镇痛。抽取外周血，采用聚合酶链反应-限制性条带长度多态性方法（PCR-RFLP），分析患者CYP2D6*10等位基因及MDR1 C3435T基因多态性，比较不同基因型患者之间曲马多的累积量，记录镇痛起效时间、持续时间、VAS及不良反应。 结果 CYP2D6*10等位基因频率为52.84%，术后2、6、12h曲马多累积量及术后2、6hVAS的比较，m/m型明显高于w/w型和m/w型，差异有统计学意义（P＜0.05）。MDR1 C3435T等位基因频率为38.14%，3种不同基因型患者术后曲马多累积量及VAS的比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。 结论在浙南地区女性人群中，CYP2D6*10等位基因对曲马多镇痛效果有显著影响，MDR1 C3435T等位基因对曲马多镇痛效果无显著影响。

MDR1 C3435T CYP2D6*10 术后镇痛 基因多态性 曲马多

曲马多是一种常用的非麻醉性中枢镇痛药，轻中度疼痛作用效果与吗啡相当，具有对呼吸和心脏抑制轻、长期应用不易成瘾、耐受危险性小等特点，近年来广泛使用于治疗轻中度的疼痛及中小型手术术后镇痛。曲马多在体内主要经肝脏代谢，其中O-去甲基曲马多（M1）是唯一有活性的代谢产物，镇痛作用是母体药物的2～4倍。M1主要通过CYP2D6代谢，故曲马多的药代动力学和药效均与CYP2D6的活性相关。CYP2D6的活性主要受基因的调控，其基因多态性达70余种，且发生率在不同种族中差异明显[1]。有实验证实，曲马多的药代动力学也受MDR1 C3435T基因多态性的影响[2]。本研究通过比较CYP2D6*10与MDR1 C3435T不同基因型的浙南地区女性个体对曲马多镇痛效果的差异，以阐述不同基因型对曲马多代谢及镇痛效果的影响。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2010-08—2012-03本院妇科行子宫肌瘤剥除手术患者，共258例，其中64例因采血失败、不合作、缺乏医生随访、初期疼痛视觉模拟评分（VAS）＜2以及有严重恶心、呕吐等原因中途退出试验，实际进入试验为194例患者，均为汉族，浙南地区女性，年龄19～55（37.74±10.25）岁，身高147～172（159.34±7.48）cm，体重40～80（55.16±7.11）kg，ASAⅠ～Ⅱ级。排除患有严重肝脏和肾脏疾病、糖尿病、抑郁症、焦虑症、长期使用止痛药的患者，术前1周服用解热镇痛类或者阿片类药物者，使用与曲马多药代动力学相抵触的联合制剂者。实验方案经本院伦理委员会批准，所有患者均充分了解研究方案并签署知情同意书。

1.2 方法 麻醉方式选用连续硬膜外麻醉，在腰椎2～3间隙行硬膜外穿刺，经硬膜外隙给予2%利多卡因和0.5%罗哌卡因连续硬膜外阻滞，麻醉平面控制在胸8以下，术中监测心电图、无创血压、血氧饱和度，术毕拔除硬膜外导管。曲马多是术后唯一使用的镇痛药物，在手术结束前30min予肌肉注射曲马多100mg负荷剂量，接上镇痛泵，采用患者自控镇痛（PCA）模式。药物配置：曲马多2.67mg/ml，甲氧氯普胺0.3mg/ml，共150ml。按持续量2.0ml/h，PCA量0.5ml，锁定时间15min给药，持续静脉镇痛48h。

1.3 观察指标 镇痛效果评估指标采用VAS法，0分为无痛，10分为最痛，并在患者静息状态记录VAS分值。如果镇痛效果差（静息下VAS＞4），则额外单次静脉注射曲马多50mg直至VAS＜4。患者入院即记录VAS作为基础对照值，并依次记录术后2、6、12、24、48h VAS分值。术前一晚由固定的精神科医生对患者进行抑郁自评量表（SDS）、焦虑状态/特性询问表（STAI）、艾森克个性问卷（EPQ）评估。测评结束后将粗分根据相应公式转换成标准分，消除心理因素及其他因素对术后镇痛的影响。

1.4 基因型分型

1.4.1 DNA提取 所有受检者均晨起抽取静脉血3ml，采用DNA试剂盒（日本Takara公司）提取人白细胞基因组DNA。将提取好的DNA置于-80℃冰箱保存备用。

1.4.2 CYP2D6*10基因PCR反应体系、反应条件及电泳分析 CYP2D6*10采用聚合酶链反应-限制性条带长度多态性方法（PCR-RFLP）分析[3]。PCR反应体系（PCR所需试剂均由日本Takara公司提供）：反应总体积为25μl，其中内含2μl基因组DNA，2.5μl 10×PCR反应缓冲液，引物浓度为10pmol/L的上下游引物各0.5μl，Taq酶PCR混合试剂15μl，最后补充去离子水至终体积25μl，置于PCR仪（美国Perkin-Elmer公司）。PCR扩增反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性45s、53℃退火40s、72℃延伸55s，共34个循环；再72℃继续延伸8min。引物由上海生工生物技术有限公司合成，上游引物为5′-TCA ACA CAG CAG GTT CA-3′，下游引物5′-CTG TGG TTT CAC CCA CC-3′。PCR产物用Hph I酶（美国NEB公司）酶切，以测定CYP2D6*10突变的等位基因。酶切产物用3%琼脂糖凝胶电泳，120V，60min，紫外照相。

1.4.3 MDR1 C3435T基因PCR反应体系、反应条件及电泳分析 MDR1 C3435T基因多态性采用PCR-RFLP分析[4]。PCR反应体系：反应总体积为25μl，其中内含2μl基因组DNA，2.5μl 10×PCR反应缓冲液，引物浓度为10pmol/L的上下游引物各0.5μl，Taq酶PCR混合试剂12.5μl，最后补充去离子水至终体积25μl，置于PCR仪。PCR扩增反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性35s、54℃退火35s、72℃延伸60s，共35个循环；再72℃继续延伸6min。引物由上海生工生物技术有限公司合成，上游引物为5′-TGC TGG TCC TGA AGT TGA TCT GTG AAC-3′，下游引物5′-ACA TTA GGC AGT GAC TCG ATG AAG GCA-3′。PCR产物用MboI酶（美国NEB公司）酶切，以测定MDR1基因的等位基因。酶切产物用3%琼脂糖凝胶电泳，130V，60min，紫外照相。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，计量资料均以 表示，等位基因、基因型频率和遗传平衡定律（Hardy-Weinberg定律）采用χ2检验，不同基因型组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 基因分型

2.1.1 CYP2D6*10基因分型 PCR扩增产物长度为394 bp。野生纯合型（w/w型）酶切产物为323、71bp，共2个条带；突变纯合型（m/w型）酶切产物有223、100、71 bp，共3个条带；突变杂合型（m/m型）则有323、223、100、71bp，共4个条带（图1）。

2.1.2 MDR1 C3435T基因分型 PCR扩增产物长度为248bp，野生纯合型（CC型）为172、60、16bp，共3个条带；突变杂合型（CT型）为232、172、60、16bp，共4个条带；突变纯合型（TT型）为232、16bp，共2个条带（图2）。

2.2 基因突变频率 CYP2D6*10基因突变频率为52.84%，w/w型39例，m/w型105例，m/m型50例。MDR1 C3435T突变频率为38.14%，CC型77例，CT型86例，TT型31例。CYP2D6*10及MDR1 C3435T基因型分布均符合Hardy-Weinberg定律，见表1。

图1 CYP2D6*10基因分型电泳图（M为Marker；1、4、5、6、7、10、11为w/w型；3、8为m/m型；2、9为m/w型）

图2 MDR1 C3435T基因分型电泳图（M为Marker；6、8为CC型；2、4为CT型；1、3、5、7、9为TT型）

表1 两种基因型及等位基因频率

2.3 两种基因型各子型患者一般资料的比较 见表2。

表2 两种基因型各子型患者一般资料的比较

由表2可见，两种基因型各子型患者的年龄、体重、身高、BMI、手术持续时间的比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.4 CYP2D6*10不同基因型患者术后曲马多累积量及VAS的比较 见表3、4。

表3 CYP2D6*10不同基因型患者术后PCA镇痛期间曲马多累积量（mg）

表4 CYP2D6*10不同基因型患者术后PCA镇痛期间VAS比较

由表3、4可见，与w/w型相比，m/m型术后PCA镇痛期间曲马多负荷量及术后2、6、12h曲马多累积量均明显增多，分别增加8.50%、10.40%、2.70%和3.12%，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而与m/w型比较差异无统计学意义（P＞0.05）。3种不同基因型患者术后24、48h曲马多累积量的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。m/m型术后2、6h VAS分值均高于w/w型与m/w型，与w/w型相比差异有统计学意义（P＜0.01），但与m/w型相比差异无统计学意义（P＞0.05）。3种不同基因型患者术后12、24、48hVAS分值的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.5 MDR1 C3435T不同基因型患者术后曲马多用量及VAS比较 见表5、6。

表5 MDR1 C3435T不同基因型患者术后PCA镇痛期间曲马多累积量（mg）

表6 MDR1 C3435T不同基因型患者术后PCA镇痛期间VAS比较

由表5、6可见，3种不同基因型患者术后2、6、12、24、48h曲马多累积量及VAS分值的比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.6 不良反应发生情况 两基因型各子组中仅7例患者出现恶心、呕吐、大汗等不良反应，其中CYP2D6*10基因w/w型2例，m/w型3例，m/m型2例，MDR1 C3435T基因CC型3例，CT型4例，TT型未发生。

3 讨论

3.1 CYP2D6*10基因多态性与曲马多药效的关系CYP2D6是具有高度多态性的异构酶，在人群中分为四种代谢表型：慢代谢型、中间代谢型、快代谢型和极快代谢型。本研究CYP2D6*10基因检测中，w/w型39例、m/w型105例、m/m型50例，等位基因频率为52.84%，m/w型为25.77%，可以从一定程度上反映该基因在浙南地区女性人群中的发生频率。相关文献报道的不同人群CYP2D6*10等位基因频率如下：广东57.2%，香港64.7%，台湾70.0%，新加坡62.0%，高加索5.1%，南美1.5%，东方人的突变频率高达51%[5-9]。由此可见，CYP2D6*10基因多态性在高加索人群与蒙古利亚人群之间存在着显著的种族差异[9]，这种DNA分子水平的差异是CYP2D6酶代谢表型存在种族差异的遗传基础[10]。虽然国内已有关于CYP2D6基因多态性与药物代谢关系的研究[11]，但目前尚缺乏关于浙南地区女性人群CYP2D6基因表型与曲马多药效个体差异的研究，本课题首次系统地阐明了引起浙南地区女性人群曲马多药物代谢及临床药效个体差异和种族差异的遗传因素。

本研究194例子宫肌瘤剥除手术中，平均疼痛强度在术后2h内达到最大值，随后趋于平稳，术后大约6h开始呈下降趋势。与w/w型相比，m/m型曲马多术后镇痛的负荷量和术后2、6、12h曲马多累积量分别增加了8.50%、10.40%、2.70%和3.12%，术后2、6hVAS分值均明显增高。本实验结果表明，CYP2D6*10基因多态性会影响曲马多术后PCA镇痛早期效果，其中m/w型镇痛效果较差且术后首日需要较多的镇痛药量，可能因CYP2D6*10基因突变，减慢了体内曲马多向其主要活性代谢产物Ml的转化，进而降低了曲马多术后持续静脉及PCA镇痛的效果，增加了镇痛早期镇痛药物的需要量[12]。CYP2D6*10基因多态性是引起浙南地区女性人群曲马多药物代谢个体和种族差异的重要遗传因素，同时也是引起曲马多术后镇痛药效学个体差异的原因之一。

3.2 MDR1 C3435T基因多态性与曲马多药效的关系国外有研究表明，MDR1基因影响P-糖蛋白功能，限制药物底物渗透到中枢神经系统的浓度，其中MDR1 3435TT基因型可引起P-糖蛋白的低表达[13]。也有研究表明[2]，欧洲捷克人群中MDR1多态性可能是影响曲马多镇痛效应的重要遗传因素之一。当前国内MDR1基因研究较多的有G2677T、G2677A、C3435T、C1236T、单核苷酸。C3435T在中国健康志愿者中频率为40%,本研究主要对象为浙南地区女性人群，突变频率为38.14%，与上述研究结果相似。本研究结果显示，MDR1 C3435T基因多态性CC、CT、TT 3种基因型间48h曲马多累积量差异无统计学意义（P＞0.05）。

国内有研究报道，MDR1 C3435T基因多态性与芬太尼术后镇痛效应相关，CT、TT型患者的芬太尼镇痛用量显著低于CC型[14]。而本实验使用药物为曲马多，其镇痛效果不及芬太尼，在一定程度上缩小了不同基因型组间镇痛药物剂量的差异，其次可能P-糖蛋白对曲马多代谢产物透过血脑屏障的能力影响甚微，或者MDR1 C3435T基因多态性并非是引起中国浙南地区女性人群曲马多镇痛效果差异的遗传因素，故导致该结果与本实验结果不一致。由于曲马多镇痛作用机制的复杂性,本试验的研究结果仍需要多中心、大样本的研究来证实。

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Association of CYP2D6 and MDR1 polymorphisms with analgesic efficacy of tramadol in woman patients of Southern Zhejiang Province

MA Guanfan,CHEN Qianhuan.Department of Anesthesiology,Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital

of Wenzhou,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the association of CYP2D6*10 and MDR1 C3435T polymorphisms with analgesic efficacy of tramadol in woman patients of Southern Zhejiang province. Methods One hundred and ninety four patients with hystermyoma undergoing uterine myomatectomy from August 2010 to March 2012.Patients were given with loading dose of tramadol intramuscularly 30 minutes before the ending of surgery and received the postoperative patient-controlled analgesia(PCA). Samples of peripheral blood were collected for DNA isolation.Polymorphisms of CYP2D6*10 and MDR1 C3435T were detected with PCR-RFLP analysis.The differences of tramadol consumption in the genotype groups were monitored and the starting time and duration of analgesia,VAS scores and adverse reaction were observed. Results The allelic frequency of CYP2D6 was 52.84%.The tramadol consumption at 2、6h and 12h after surgery and VAS at 2h and 6h after surgery in m/m type(n=50)were higher than those in w/w(n=39)and m/w(n=105)type(P＜0.05).Variant alleles C3435T in MDR1 gene was seen in frequency of 38.14%.There were no significant differences in postoperative tramadol consumption and VAS among CC type (n=77),CT type (n=86)and TT type(n=31). Conclusion CYP2D6*10 is significantly associated with analgesic efficacy of tramadol in woman patients of Southern Zhejiang province,while C3435T in MDR1 has no such association.

MDR1 C3435T CYP2D6*10 Postoperative analgesia Polymorphisms Tramadol

2012-10-15）

（本文编辑：严玮雯）

325000 温州市中西医结合医院麻醉科

马光泛，E-mail：ma0106003@sohu.com