雷公藤内酯醇对小鼠肾小球足细胞裂孔隔膜核心蛋白表达干预作用的研究

叶迅 洪郁芝 徐新鹏

雷公藤内酯醇对小鼠肾小球足细胞裂孔隔膜核心蛋白表达干预作用的研究

叶迅 洪郁芝 徐新鹏

目的 观察雷公藤内酯醇（TP）干预高糖环境培养的小鼠肾小球足细胞裂孔隔膜nephrin、podocin和CD2AP的表达，探讨雷公藤治疗糖尿病肾病（DN）蛋白尿的分子生物学机制。方法培养成熟的小鼠足细胞随机分为对照组1、对照组2、高糖组和TP干预组，TP干预组进一步分为低剂量、中剂量和高剂量组。用不同浓度的TP（8、16和32ng/ml）干预高糖（25mmol/L的Glu）培养24h后的小鼠足细胞，用RT-PCR法检测干预前后nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达；用间接免疫荧光法检测16ng/ml TP干预后nephrin和podocin蛋白的表达。结果（1）与对照组相比，高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA表达均明显减弱（均P＜0．01）。（2）TP显著上调高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达（均P＜0．05）。（3）16ng/ml TP能明显上调高糖对足细胞nephrin和podocin（均P＜0．05）蛋白表达的抑制。结论TP显著上调高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP的表达，可能是其降低DN蛋白尿的机制之一。

雷公藤内酯醇 糖尿病肾病 肾小球足细胞裂孔隔膜 核心蛋白

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of triptolide(TP)on the expression of GPSD core proteins in mouse podocytes induced by high glucose．MethodsThe cultured mouse podocyte were randomly divided into control group1,control group2,high glucose group and TP treatment groups,which were further divided into low,middle and high dose subgroups．Podocyte exposed to 25 mmol/L glucose were treated with different doses of triptolide(8,16 and 32ng/ml)．The expressions of nephrin,podocin and CD2AP mRNA were examined by RT-PCR．The expressions of nephrin and podocin protein were detected by indirect immunoflorescence technique(IIFT)．ResultsCompared to control group,the expression of nephrin,podocin and CD2AP mRNA in high glucose group were significantly decreased (P＜0．05 or P＜0．01)．Compared to high glucose group,the expression of nephrin,podocin and CD2AP mRNA were significantly up-regulated(P＜0．05)in 3 TP-treatment groups,and the expression was highest in middle dose group(P＜0．05)．IIFT demonstrated that the inhibited expression of nephrin and podocin by high-glucose was significantly up-regulated in the middle dose group．ConclusionThe expressions of nephrin,podocin and CD2AP in the mouse podocyte are inhibited in high glucose condition．These core proteins inhibited in high glucose can be significantly up-regulated by triptolide,indicating that it may attenuate the proteinuria in diabetic hephropathy．

蛋白尿不但是糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）的临床特征，更是导致其恶性进展的重要因素。新近的研究发现，肾小球足细胞裂孔隔膜（glomerular podocyte slit diaphragm，GPSD）上的多个核心蛋白，如nephrin，podocin和CD2AP表达的异常是导致包括DN的多种慢性肾病蛋白尿形成的主要原因[1]。近年来，雷公藤治疗非DN和DN相关性蛋白尿的作用已被临床证实[2-3]，但其降低蛋白尿的机制是否与影响GPSD核心蛋白表达有关，目前尚无文献报道。本研究通过观察雷公藤内酯醇（Triptolide，TP）干预高糖环境培养的小鼠足细胞nephrin、podocin和CD2AP的表达，旨在进一步阐明雷公藤治疗DN蛋白尿的分子生物学机制。

1 材料和方法

1.1 小鼠足细胞的复苏、冻存与传代 复苏-196℃液氮罐冻存的小鼠足细胞（由英国伦敦大学国王学院Guy’s医院赠送），0.25%胰蛋白酶液1ml，室温下消化，细胞变圆、细胞间隙增宽时，终止消化，置33℃、5%CO2培养箱孵育，待细胞长至80%～90%融合时再传代培养。

1.2 小鼠足细胞培养 将复苏的小鼠足细胞转入含有5ml 10%FCS1640培养液的50ml塑料培养瓶，每瓶加入50U小鼠γ-干扰素/mlRPMI1640培养基。置33℃、5% CO2培养箱孵育，细胞增殖传代后，转移入37℃、5%CO2培养箱（培养基不变不含γ-干扰素）分化成熟。

1.3 实验分组和培养 将分化成熟的“树枝状”足细胞传代至30瓶，如下分6组，每组5瓶细胞：对照组1（CG1组）：10%FCS RPMI1640培养基；对照组2（CG2组）：5mmol/L Glu，10%FCS RPMI1640培养基；高糖组（HG组）：25mmol/L Glu，10%FCS RPMI1640培养基；低剂量TP组（LTP组）：8ng/ml TP，25mmol/L Glu，10%FCS RPMI1640培养基；中剂量TP组（MTP组）：16ng/ml TP，25mmol/L Glu，10%FCS RPMI1640培养基；高剂量TP组（HTP组）：32ng/ml TP，25mmol/L Glu，10%FCS RPMI1640培养基。6组在37℃、5%CO2培养箱孵育24h后供实验检测指标。用不同浓度（8、16和32ng/ml）的TP干预高糖组培养24h后的小鼠足细胞。置37℃、5%CO2培养箱中孵育24h后供RT-PCR使用。

1.4 RT-PCR半定量法检测TP干预前后小鼠足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达 Trizol试剂和氯仿抽提足细胞总RNA，微量核酸测量仪测定每个RNA样品的浓度（单位为μg/ml）；逆转录酶M-MuLV催化下合成cDNA；在DNA自动扩增仪上进行PCR反应。25μl反应体系中含10×buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，引物正反义链各10pmol，TaqDNA聚合酶（购自上海博亚生物技术有限公司）1.5U，cDNA 1μl，加去离子水至终体积25μl，石蜡油封闭。PCR引物均根据已知的小鼠Nephrin、CD2AP、Podocin、GAPDH和GAPDH由PRIMER 5.0引物软件设计（表1），由上海生物工程公司合成。

表1 PCR引物序列

扩增反应条件：Nephrin：95℃3min，进入循环，95℃30s、58℃30s、72℃60s，40个循环后，72℃10min；Podocin：95℃3min，进入循环，95℃30s、60℃30s、72℃60s，40个循环后，72℃10min；CD2AP：95℃3min，进入循环，95℃30s、57℃30s、72℃60s，45个循环后，72℃10min；GAPDH：95℃5min，进入循环，95℃30s、56℃30s、72℃30s，40个循环后，72℃10min。阴性对照以双蒸水替代cDNA。各PCR产物与DNA Marke（r购自上海博亚生物技术有限公司）在1.7%琼脂糖凝胶（含0.5mmol/L溴化乙锭），0.5%TBE液中电泳（100V，30min），用BIO-RAD凝胶成像系统、Quantity-one软件分析目的基因与内参的比值。

1.5 间接免疫荧光法检测nephrin和podocin蛋白表达 选择分化成熟的足细胞数瓶，用0.25%胰蛋白酶/ 0.0372%EDTA消化液消化离心，10%FCS RPMI培养液配成（104～105/ml）细胞悬液。传代接种至六孔培养板进行细胞爬片。分为：对照组a（ 10%FCS RPMI1640培养基）、高糖组a（25mmol/L Glu，10%FCS RPMI1640培养基）；中剂量TP组a（16ng/ml TP，25mmol/L Glu，10% FCS RPMI1640培养基），每组3孔，孵育24h。室温干燥20min，-20℃丙酮固定液固定玻片10min后风干。PBS漂洗、晾干，滴加一抗（1∶50稀释）50μl，37℃孵育30～40min，阴性对照用PBS代替一抗。PBS漂洗3次，每次5min。滴加二抗（1∶200稀释）50μl，室温孵育30min。PBS漂洗3次，每次5min。荧光显微镜下观察干预前后足细胞nephrin和podocin蛋白表达。

1.6 统计学处理 采用SPSS 15.0统计软件，测得计量数据以表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 小鼠足细胞在不同温度条件下形态学变化 在33℃条件下细胞呈现“鹅卵石状”，胞体较小，在小鼠γ-干扰素诱导下不断地增生传代；在37℃条件下，经1～2周时间，逐渐长出足突，胞体变大，足突与足突之间相互连接，足细胞逐渐分化成熟为“树枝状”。

2.2 TP对高糖刺激下足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA表达的影响 见表2、图1～3。

由表2，图1～3可见，与CG1组比较，CG2组、HG组和不同浓度TP组足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。其中以HG组nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达最低（均P＜0.01）。与HG组比较，不同剂量TP组均上调nephrin、podocin和CD2AP mRNA表达（均P＜0.05），其中以MTP组干预效果最显著，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 各组nephrin,podocin,CD2AP mRNA的表达（n=5）

图1 TP在高糖环境下对足细胞nephrin mRNA表达的影响

图2 TP在高糖环境下对足细胞podocin mRNA表达的影响

图3 TP在高糖环境下对足细胞CD2AP mRNA表达的影响

2.3 TP对高糖刺激下足细胞nephrin和podocin蛋白表达的影响 细胞免疫荧光检测显示，与对照组a比较，高糖组nephrin和podocin蛋白的表达显著减弱。中等剂量TP组a 足细胞nephrin和podocin蛋白的表达与高糖组a相比均有一定程度提高，具体见图4～5。

图4 足细胞nephrin的表达（A：对照组a ；B：高糖组a ；C：中剂量TP组a，×400）

图5 足细胞podocin的表达（A：对照组；B：高糖组；C：中剂量TP组，×400）

3 讨论

DN是糖尿病最常见的慢性并发症之一，是导致终末期肾衰的主要病因。蛋白尿贯穿于DN整个病程，表现为早期的微量白蛋白尿，逐渐发展到难治性大量蛋白尿，最后出现肾功能不全。蛋白尿不仅与DN肾损伤程度密切相关，而且是直接导致肾功能恶化的重要危险因子。近年来研究发现，GPSD上的多个核心蛋白，如nephrin，podocin和CD2AP表达的异常是导致包括DN的多种慢性肾病蛋白尿形成的主要原因。

GPSD是血浆蛋白通过脉管系统的最后屏障，对于维持肾小球滤过屏障结构与功能完整性发挥关键作用。越来越多的研究表明在长期高血糖环境，DN肾小球“三高”对局部毛细血管袢机械牵张力，以及蛋白尿本身的慢性刺激下可通过血管紧张素Ⅱ在肾脏局部的浓聚，诱导氧化应激反应，激活细胞因子系统，尤其是TGF-β1和VEGF，造成GPSD上的核心蛋白表达下降，足细胞损伤、凋亡，足突融合，促进DN蛋白尿的发生与进展[5]。由于足细胞是一种高度分化的有限增殖细胞，一旦损伤后，病变不可逆，所以目前对DN防治的研究更进一步在于通过对足细胞保护从而减少蛋白尿的发生和进展。

在肾脏病领域中，雷公藤对各种免疫损伤性肾脏疾病所显示的降低蛋白尿、保护肾功能的确切疗效已得到一致公认[5-6]。雷公藤系卫矛科雷公藤属木质藤本植物，其药用成分主要取自根部，作为祛风止痛中药使用已有两千多年历史。

晚近研究表明，雷公藤还具有降低DN相关性蛋白尿的作用[4]。临床研究发现，雷公藤能明显缓解DN患者蛋白尿，减少糖尿病动物模型肾小球系膜区细胞外基质（ECM）堆积，改善肾组织病理改变。以往研究表明，雷公藤降低蛋白尿的机制主要与保护和修复肾小球滤过屏障有关，但后者是否与雷公藤影响GPSD核心蛋白表达有关，目前尚无文献报道。TP为二萜化合物，是雷公藤生物活性最强的单体成分。近期的研究发现，TP有效降低嘌呤霉素核苷酸诱导的大鼠肾损害的蛋白尿，该作用与改善足突融合，减少足细胞损伤标记物desmin的表达和恢复nephrin和podocin的表达及分布密切相关[7]。本研究通过观察在单纯的高糖环境培养下，TP干预小鼠足细胞GPSD核心蛋白nephrin、podocin和CD2AP的表达，来进一步阐明雷公藤治疗DN蛋白尿的分子生物学机制。

本实验观察到，在5mmol/L的Glu环境下，足细胞GPSD核心蛋白nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达即开始显著下降，尤其当Glu浓度增高到25mmol/L时，表达下降最显著。TP均可显著上调高糖对nephrin、podocin和CD2AP mRNA表达的抑制，但其上调作用并非呈浓度依赖性，而以中等剂量16ng/ml TP上调作用最显著，细胞免疫荧光亦支持上述高糖对足细胞GPSD核心蛋白nephrin和podocin表达的抑制现象，并且16ng/mlTP可有效上调后者的表达。

本研究的结果提示，体外不同Glu浓度培养的足细胞其nephrin、podocin和CD2AP等GPSD核心蛋白的表达下降，这可能与DN蛋白尿的发生发展有关。而雷公藤降低DN蛋白尿的机制可能与TP能显著上调高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP的表达有关。然而，深入阐明GPSD核心蛋白表达与DN蛋白尿发生之间的关系，以及雷公藤保护足细胞，降低DN蛋白尿的作用机制有待于相关体内研究进一步证实。

[1]Braun N,Grone H J,Schena F P,et al．Immunological and non-immunological mechanisms of proteinuria[J]．Minerva Urol nefrol, 2009,61(4):385-396．

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[3]Gao Q,Shen W,Qin W,et al．Treatment of db/db diabetic mice with triptolide:a novel therapy for diabetic nephropathy[J]．Nephrol Dial Transplant,2010,25(11):3539-3547．

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[5] Tao X,Fan F,Hoffmann V,et al．Effective therapy for nephritis in (NZB x NZW)F1 mice with triptolide and tripdiolide,the principal active components of the Chinese herbal remedy Tripterygium wilfordii Hook F[J]．Arthritis Rheum,2008,58(6):1774-1783．

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Effect of triptolide on expression of GPSD core proteins in mouse podocytes induced by high-glucose

Triptolide DN GPSD Core protein

2012-10-19）

（本文编辑：沈昱平）

浙江省中医药管理局科研基金资助项目（2006C106）

310007 杭州市中医院内分泌代谢科

洪郁芝，E-mail：hyzhcy@aliyun.com