MicroRNAs在消化道疾病中的作用研究进展

于兰，杨云生

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为18～24个核苷酸的非编码单链小分子RNA，广泛存在于植物和动物中，主要参与基因转录后水平的调控。目前研究发现miRNAs通过与靶基因3'非翻译区(3'UTR)的完全或不完全配对，降解靶基因mRNA或抑制其翻译，从而影响细胞和组织的功能[1]。继1993年在果蝇中发现第一个miRNA以来，miRNAs被发现广泛存在于各个物种中，截止到2013年3月，发现的miRNAs总数已达21 264种，其中成熟的人类miRNAs已达2216种(www.mirbase.org)。大量研究表明，miRNAs参与了包括细胞分裂、增殖、分化，个体发育以及代谢等许多重要的生物学过程[2]。miRNAs的差异表达不仅可能与消化道肿瘤的发生、复发转移及预后有关，在一些消化道良性疾病如肠易激综合征及炎症性肠病等的发生发展中也起着重要作用。本文主要探讨miRNAs在消化道疾病方面的作用研究进展，并探讨值得关注的研究方向。

1 miRNAs的形成及调控机制

miRNAs由具有发夹结构的70～90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工后形成。成熟miRNA的生物合成过程包括：经RNA聚合酶Ⅱ起始转录为原始miRNA；经RNA酶Ⅲ Drosha和DGCR8剪切为约65个核苷酸的pre-miRNA；由胞核运送至胞质后被RNA酶Ⅲ Dicer进一步剪切为21～23个核苷酸的双链mtRNA。双链miRNA分子被解链后，单链miRNA进入核糖蛋白复合体miRNP(RISC)，之后再通过与靶基因3'UTR互补配对，指导miRNA复合体对靶基因mRNA进行切割或翻译抑制[3]。目前研究表明，每个miRNA可通过多个结合位点调节多个靶mRNAs，每个基因也受到多个miRNAs的调控[4]。miRNAs的表达模式具有高度保守性、时序性和组织特异性，在不同组织、不同发育阶段中表达水平有显著差异，是调控其他功能基因表达的重要分子。

2 miRNAs在消化道疾病中的作用

2.1 miRNAs与食管癌 食管癌分为食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)和食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cancer，ESCC)。Barrett食管(Barrett's sesophagus，BE)是公认的EAC的癌前病变，研究发现BE患者发生EAC的概率是正常人的30倍[5]。目前研究表明在正常食管、BE及EAC的发展过程中存在不同的miRNAs表达谱。Feber等[6]的研究指出miR-21、miR-192、miR-193、miR-194在正常食管、BE和EAC组织中表达依次升高。Yang等[7]的研究也指出在BE发展为EAC的过程中存在miRNAs的差异表达，其中从低级别不典型增生到高级别不典型增生的过程中miR-200a*、miR-513、miR-125b、miR-101和miR-197表达升高，miR-23b、miR-20b、miR-181b、miR-203、miR-193b、miR-636表达降低，在高级别不典型增生到EAC的过程中7种miRNAs表达降低，包括let-7b、let-7a、let-7c、miR-345、miR-494和miR-193a。有报道指出miR-196a在正常食管组织-不典型增生-EAC的过程中表达依次增加，且验证了其通过调控靶基因ANXA1、SPRR2C、S1009和KRT5调控EAC细胞的凋亡。

miRNAs不仅和EAC患者的疾病程度相关，也和患者的预后相关。Mathe等[8]和Feber等[9]的研究指出，EAC细胞中miR-99b、miR-199a升高且和淋巴结转移相关。另一项研究指出miR-30e、miR200a与EAC患者的生存率相关，且miR-30e表达升高的患者术后复发的风险增加了2.5倍，该研究还指出miR-126升高也与淋巴结转移相关[10]。Hummel等[11]的研究指出，EAC组织中miR-21升高，且和局部淋巴结转移相关，并指出miR-148和EAC的分化呈负相关，miR-148的过表达提高了EAC细胞对顺铂和5-氟尿嘧啶的敏感性。上述研究结果提示miRNAs不仅可以作为诊断EAC的分子学标志，还有可能为进一步的靶向治疗提供分子学基础。

ESCC是食管癌中最常见的病理类型，目前的研究表明ESCC中存在多种miRNAs差异表达。Feber等[12]的研究指出miR-21、miR-93、miR-192、miR-194在ESCC组织中表达升高。另一项研究也证实miR-21、miR205在ESCC中表达升高，且miR-21的过表达通过抑制靶基因PTEN、PDCD4促进食管鳞癌细胞的生长[13]。Ogawa等[14]的研究指出miR-23a、miR-26a、miR-27b、miR-96、miR-128b和miR-129在ESCC中升高且和预后相关，其中miR-129升高的患者术后预后较差。研究表明，miR-203和miR-205在ESCC中降低，miR-27b、miR-125b、miR-100在ESCC及EAC中均降低[15]。另外还有研究证实miR-203、miR210在ESCC中表达下调，且miR-203和原癌基因ΔNP63、miR-210和原癌基因FGFRL1之间存在靶向调控关系，ΔNP63和FGFRL1的表达上调可促进食管鳞癌细胞的增殖[16]。

miRNAs的差异表达与ESCC患者的转移和预后相关。Hamano等[17]的研究指出，miR-21和miR-200c与ESCC患者的预后相关，癌旁食管黏膜中miR-21升高的患者预后较差，同时该研究还发现miR-200c通过抑制其靶基因PPP2R1B降低ESCC患者对化疗药物的敏感性。Akagi等[18]的研究也证实ESCC组织中miR-21的表达升高并与淋巴结转移相关。miR-103、miR-107、miR-296在ESCC中的过表达与患者的预后呈负相关，并且miR-296和化疗药物耐药相关[19]。研究表明，ESCC组织中miR-143和miR-145表达下调并与肿瘤的转移呈负相关，Kano等[20]的研究进一步证实miR-145的靶基因为FSCN，该基因表达升高可抑制肿瘤细胞的生长和侵袭，从而起到保护作用，此外，miR-145还与ESCC患者的生存率呈负相关。

2.2 miRNAs与胃癌 胃癌是一种多基因疾病，其发生发展是一个多步骤参与、多种相关基因失活的结果。一些miRNAs具有促细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用。目前研究较多且作用机制较明确的是miR-21，其与胃癌的发生、发展以及预后有着密切联系。目前研究发现，人类胃癌组织中miR-21呈明显的高表达，且miR-21在幽门螺杆菌(Hp)感染的胃黏膜中也存在明显高表达[21]，提示胃癌组织中miR-21的高表达可能部分与Hp感染有关。miR-21的过度表达可明显增强人类胃癌AGS细胞系的增殖和侵袭力，而通过抑制剂沉默miR-21可导致细胞增殖明显减少，凋亡明显增加。目前的研究表明，凋亡相关基因PDCD4是miR-21的靶基因，miR-21通过对PDCD4基因的翻译抑制实现其致癌作用[22]。Jin等[23]的研究表明，胃癌组织中miR-192和miR-215表达明显上调。胃癌中miR-372表达上调，并通过降低靶基因LASTS2的表达来调节细胞的增殖和凋亡[24]。Zhang等[25]的研究发现胃癌中miR-650表达上调，并抑制其靶基因ING4的表达，促进了肿瘤的发生，为胃癌的分子靶基因治疗提供了可能的分子基础。此外miR-106表达上调在胃癌细胞系中得到了证实，其水平与肿瘤分期、大小、分化程度、淋巴结和远处转移、侵袭等密切相关。

miRNAs既可作为致癌基因也可作为抑癌基因在肿瘤的发生发展中发挥作用。Guo等[26]的研究发现miRNA-331-3p可直接作用于细胞周期相关因子E2F1，导致人类胃癌细胞生长停滞，故有可能作为一个有潜力的抑癌基因，在胃癌治疗中发挥作用。miR-141是miR-200家族的成员，已被报道与多种人类恶性疾病相关。研究表明，miR-141在胃癌组织中表达明显降低，而miR-141及其前体过表达可显著抑制胃癌细胞的增殖，提示在胃癌的发生机制中miR-141可能作为抑癌基因发挥对细胞增殖的抑制作用[27]。研究发现，在胃癌组织中低表达的miR-622可通过靶向调控生长抑制因子ING1促进胃癌细胞的侵袭与肿瘤的转移[28]。

2.3 miRNAs与肠易激综合征 肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是以腹痛或腹部不适，伴有大便性状改变和排便习惯改变为特征的功能性肠道疾病，是消化科的常见病。目前关于miRNAs在IBS发病机制中作用的研究很少。2008年，Kapeller等[29]首先报道了miRNA通过调节5-HT受体基因的表达参与腹泻型肠易激综合征(IBS-D)的发生。真正阐明miRNA如何通过调控基因表达参与IBS发生的是2009年Zhou等[30]的研究。该研究发现，与健康人群相比，肠道通透性升高的IBS-D患者外周血微泡、小肠和结肠黏膜组织中的miR-29a表达均升高，体外细胞实验证实谷氨酰胺合成酶基因(GLUL)是miR-29a的靶基因，miR-29a通过负调节谷氨酰胺合成酶的表达而导致谷氨酰胺合成减少，从而增加肠道黏膜通透性，进一步实验表明沉默miR-29a或补充谷氨酰胺均可改善肠道细胞的通透性，从而为IBS-D的治疗提供了新的靶标。以上研究提示miRNAs可通过调节IBS病理生理过程中某些基因的表达从而参与其发生，所以，寻找IBS相关的miRNAs可能为其诊断和治疗提供有力工具。

2.4 miRNAs与炎症性肠病 炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's disease，CD)，是一类以结直肠黏膜及黏膜下层非特异性炎症为特征的疾病。miRNAs可通过影响下游炎症因子的分泌或参与免疫系统的发育和分化过程，参与慢性炎症反应的发生和发展。近年研究发现，IBD患者肠黏膜组织、血液、粪便中均存在多种miRNAs表达异常，且与疾病活动度、病变部位等相关。2008年，Wu等[31]通过miRNAs芯片首次报道了UC、CD、IBS患者结肠黏膜中miRNAs的表达情况，并与正常人结肠黏膜进行比较，结果发现，在活动性UC患者结肠黏膜中miR-192、miR-375、miR-422b表达明显下降，miR-16、miR-21、miR-23a、miR-24、miR-29a、miR-126、miR-195和let-7f表达明显上升。体外研究还发现，TNF-α可诱导miR-192表达下降，并使其靶基因——巨噬细胞炎症蛋白-2α(MIP-2α)表达上调，促进炎症过程的发生。该研究小组进一步比较了活动性UC和非活动性UC患者外周血中的miRNAs，结果发现，miR-199a-5p、miR-28-5p、miR-151-5p、miR-340*和miRplus-E1271在活动性UC患者外周血中表达升高，miR-103-2*、miR-532-3p、miR-362-3p在活动性和非活动性UC中均升高，而miR-505*表达均下降。miRNAs在静止期IBD患者中仍有变化，表明其在IBD病程的各阶段均发挥重要作用[32]。

2010年先后有3项研究报道了IBD患者结肠黏膜中miRNAs的差异表达，但未进行相应的功能分析[33-35]。Takagi等[33]研究发现miR-21和miR-155在活动性UC患者结肠黏膜中表达明显升高。既往对其他疾病的研究发现，miR-21可作为诊断早期癌症的标志物，miR-155在炎症、免疫反应中发挥重要作用。因此研究者推测在活动性UC中，miR-21和miR-155可能参与了肠道黏膜的炎症和免疫反应。Wu等[34]用miRNAs芯片检测了结肠CD及回肠末端CD中467个miRNAs的表达，结果发现5种miRNAs(miR-19b、miR-629、miR-23b、miR-106a、miR191)在结肠CD中明显升高，4种miRNAs(miR-16、miR-21、miR-223、miR-594)在回肠末端CD中升高。Fasseu等[35]应用RT-PCR法对UC和CD患者结肠黏膜进行了miRNAs检测，结果发现8种miRNAs(miR-26a、miR-29a、miR-29b、miR-30c、miR-126*、miR-127-3p、miR-196a和miR-324-3p)在UC和CD中均升高。以上结果表明miRNAs在IBD的各亚型中表达存在明显差异，可能通过影响炎症相关基因的表达参与IBD的发生。

近年来还有一些研究着眼于IBD患者结肠黏膜中miRNAs与其相应的靶基因之间的关系。Bian等[36]研究发现UC患者及硫酸葡聚糖钠盐(dextran sulphate sodium，DSS)诱导的小鼠急性UC模型中，结肠黏膜miR-150明显升高，转录因子c-Myb明显降低，并进一步证实了c-Myb为miR-150的靶基因，miR-150通过负调控c-Myb减少抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而诱导结肠上皮凋亡。Nguyen等[37]证实CD结肠黏膜中miR-7降低，CD98升高，并进一步证实CD98为miR-7的靶基因，CD98的分泌失调会引起肠道上皮细胞的增殖和分化异常。Pekow等[38]证实在UC患者结肠黏膜中miR-143表达下调且与原癌基因K-RAS存在负性调控关系，由此推测miR-143在IBD患者炎症发生及肿瘤形成方面起到了重要的调控作用。这些研究为阐明IBD的发病机制提供了新的病理生理学机制，同时也为未来治疗提供了新的靶点。

2.5 miRNAs与大肠癌 miRNAs的表达异常会导致靶基因表达发生改变，进而引起相应蛋白质的差异表达，据统计miRNAs调控了超过30%的蛋白质基因编码[39]。研究表明，miRNAs参与了细胞分化、增殖和凋亡等病理生理过程，miRNAs的表达下调会导致相应的原癌基因表达上调，同样其表达上调会导致相应的抑癌基因表达下调。2002年Calin等[40]首次报道了miRNAs和肿瘤之间的联系，他们发现miRNAs频繁地出现在肿瘤相关基因区域或脆性位点上，起到类似癌基因或抑癌基因的作用。2003年Michael等[41]首次报道了人结直肠癌组织和正常黏膜中miRNAs的差异表达，他们发现与正常黏膜组织相比，结直肠癌组织中miR-143和miR-145表达下调，将miR-143和miR-145转染入癌细胞后，癌细胞的生长可受到明显抑制。上述实验表明，这两种miRNAs是参与结肠肿瘤发生的重要因子，具有类似于抑癌基因的作用。此后有关结直肠癌中miRNAs的表达成为研究热点，仅2012年PubMed上收录的相关报道已达到100余篇，这些研究大部分集中在结直肠癌中miRNAs的差异表达，以及miRNAs通过调控相应靶基因在结直肠癌中所起的作用这两方面。

目前的研究表明，在结肠癌患者的组织、血浆及粪便中存在多种miRNAs表达异常，表达上调的有170余种，其中有关miR-21、miR-31、miR-92、miR-135b、miR-221、miR-222的报道较多，表达下调的有127余种，其中有关miR-145、miR-143、miR-1、miR-195的报道较多[42]。

Wang等[43]的研究表明，miR-21在结肠癌患者血浆中升高且在其他肿瘤如乳腺癌、食管癌、胃癌、肺癌中也升高。在最近的一项报道中，研究人员对380种miRNAs进行了分析，发现只有miR-21可以作为区分结肠癌患者和正常人的血清标志物，具有90%的灵敏度和高特异性[44]。miR-31在结直肠癌组织中表达上调，且其表达水平与患者的临床分期有关[45]。Ng等[46]对大肠癌患者进行了95种miRNAs芯片分析，结果显示，5种miRNAs(miR-17-3P、miR-92、miR-95、miR-135b、miR-222)在大肠癌患者组织和血浆中表达均增强，进一步RT-PCR证实其中miR-17-3p和miR-92的升高最为明显，其中10例大肠癌患者术后miR-17-3p和miR-92的血浆水平明显降低。对另一组90例大肠癌、20例胃癌、20例炎症性肠病和50例健康对照的血浆样本进一步验证，结果提示根据miR-92的表达水平可以区分大肠癌和胃癌、炎症性肠病及正常人，敏感性89%，特异性70%。此后的研究也证实miR-92a及miR-21在大肠癌患者的粪便中表达明显升高，根据粪便中miR-92a表达水平诊断结直肠癌的敏感性为72%，特异性为73%，且miR-92a和KARS基因突变相关[47-48]。因此，miR-92可能成为检测大肠癌的无创性分子诊断标志物。同时也有研究证实结肠癌患者粪便中miR-143、miR-145表达下调，因此检测粪便中两者的浓度可作为鉴别肿瘤和正常人的无创生物学指标[49]。Faltejskova等[50]对大肠癌组织及癌旁组织进行了667种miRNAs芯片分析，结果显示其中42种miRNAs存在差异表达，进一步RT-PCR证实其中miR-215、miR-375、miR-378和miR-422a明显下调，且miR-215及miR-422a与临床分期相关。Wang等[51]的研究指出，结肠癌患者血浆中有22种miRNAs表达下调，其中miR-601和miR-760较正常人低，两者联合检测诊断结肠癌的敏感性为83.3%，特异性为69.1%。上述研究表明miRNAs有望成为诊断大肠癌的生物学指标。

此外，还有一些研究着重于探讨miRNAs与其相应的靶基因在大肠癌中的作用机制。目前一些miRNAs与其靶基因在结直肠癌中的靶向调控关系已经得到了明确验证，如miR-21和其靶基因PETN、PDCD4、SPRY2，miR-135b和其靶基因APC，miR-101和其靶基因COX-2等。但这仅仅是miRNAs复杂而庞大家族中的极小部分，大部分miRNAs在肿瘤发生及发展中的作用还有待于进一步研究。

近两年越来越多的miRNAs与靶基因的靶向调控关系在结直肠癌组织中得到了验证。Sun等[52]在结肠癌组织中检测到miR-31表达上调，并进一步证实其靶基因是p21蛋白活化子(RASA1)。miR-31通过抑制RASA1的翻译激活RAS信号通路，从而促进结直肠癌细胞的生长及肿瘤发生。Tsuchida等[53]在结肠癌组织中发现miR-92表达上调，并证实促凋亡蛋白Bim是其靶基因，miR-92a通过抑制Bim的合成，阻止或减慢癌细胞凋亡。Sun等[54]报道miR-221在结肠癌组织中表达上调，而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDKI)的表达下调，体外实验证实miR-221通过抑制CDKI的表达促进肿瘤细胞由G0/G1期进入S期，从而促进肿瘤增殖。研究发现，结肠癌患者肿瘤组织及血浆中miR-145均降低，体外实验证实癌基因N-RAS为其靶基因，miR-145的表达下调引起N-RAS升高，从而促进癌细胞增殖[55]。另一项研究对结肠癌组织中miR-16的表达进行检测，结果发现67%的结肠癌组织中miR-16表达下调并与组织分化程度相关，体外实验证实凋亡抑制基因survivin为其靶基因，miR-16的降低引起survivin基因表达上调从而抑制结肠癌细胞凋亡，促进结肠癌细胞的增殖[56]。以上研究结果表明，在大肠癌组织中存在着多种miRNAs的表达异常，人为地干预某种miRNA的表达可能触发肿瘤的形成或凋亡。

3 展 望

目前，miRNAs在疾病发生发展过程中的作用，尤其是在炎症及肿瘤发生过程中的作用正逐渐受到重视。越来越多的研究着眼于寻找与疾病相关的miRNAs，明确其靶基因和相关的作用机制，并在此基础上开发相应的治疗药物，因此miRNAs在疾病的诊断和治疗中拥有广阔的应用前景。目前仍有很多miRNAs未被发现，已知的miRNAs所执行的功能尚不完全明确，每种miRNA都可调节多种靶基因，此外，在疾病的发生发展过程中miRNAs如何选择性地作用于某一种或某几种靶基因更有待于进一步探索。

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