柱前衍生高效液相色谱法测定门冬氨酸的含量

杨 颖，阎秀美，陈乃江

(1．江苏省连云港市药品检验所，江苏 连云港 222000;2．江苏德源药业有限公司，江苏 连云港 222000)

门冬氨酸又名 L-α-氨基丁二酸是氨基酸类药物，常用于配制复方氨基酸类药物，如门冬氨酸鸟氨酸注射液、门冬氨酸镁钾注射液等。药典标准中，采用高氯酸电位滴定法测定其含量。在文献[1-4]的基础上，本试验中建立了紫外衍生化试剂异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化测定门冬氨酸含量的方法。现报道如下。

1 仪器与试药

Aglient1260型高效液相色谱仪;BP211D型电子天平(Sartorius)。门冬氨酸对照品(中国药品生物制品检验所，批号为140691-200401);乙腈为色谱纯，磷酸钠、磷酸均为化学纯;L-门冬氨酸(上海协和氨基酸有限公司，批号分别为110103，110707，111210)。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4．6 mm，5 μm);流动相:A为12．5 mmol/L磷酸钠溶液(用磷酸调pH至6．8)，B为乙腈-水(80∶20)，按表1进行梯度洗脱;流速:1．0 mL/min;柱温:35℃;检测波长:254 nm。

表1 流动相梯度洗脱程序

2．2 溶液制备

精密称取门冬氨酸对照品25 mg，置25 mL容量瓶中，用50% 乙腈溶液溶解并稀释至刻度，精密量取 0．5，1．0，2．0，4．0，6．0，8．0 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成50，100，200，400，600，800 μg/mL 的溶液，作为对照品溶液。精密称取门冬氨酸样品12．5 mg，置100 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液溶解并稀释至刻度，即得供试品溶液。

2．3 衍生和测定方法

15%异硫氰酸苯酯乙腈溶液:量取异硫氰酸苯酯15 mL，置100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。1 mol/L三乙胺乙腈溶液:量取三乙胺14 mL，置100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。取标准品和样品各2 mL，加15%异硫氰酸苯酯乙腈溶液1 mL，加1 mol/L三乙胺乙睛溶液1 mL，混匀，室温放置1 h，加入4 mL正己烷，振摇，放置10 min，取下层清液，过滤，取20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图见图1，按外标法计算门冬氨酸含量。

图1 高效液相色谱图

2．4 方法学考察

标准曲线绘制:分别精密量取2．2项下对照品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪按2．3项下条件进行测定，测量峰面积。以对照品质量浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程 Y=15．712 X ＋11．999，r=0．999 8。结果表明，门冬氨酸质量浓度在50～800 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密吸取对照品溶液20 μL，重复进样6次，按上述色谱条件测定峰面积。结果的 RSD=0．93%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液，分别于 0，2，4，6，8，12，24 h 时进样 20 μL。结果门冬氨酸峰面积的 RSD=0．62%(n=7)，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验:取同一批样品，按上述方法制备6份供试品溶液，依法测定，结果平均含量为99．3%，RSD=1．0%(n=6)。表明方法重复性良好。

加样回收试验:取已知含量的门冬氨酸(批号为110103，含量为99．3%)9份，各约25 mg，分别精密加入门冬氨酸对照品适量，按2．3项下条件测定进样，测定含量，计算回收率。结果见表 2。

表2 门冬氨酸加样回收率试验结果(n=9)

2．5 样品含量测定

取3批不同批号的门冬氨酸原料，依法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶试液20 μL，按上述色谱条件测定并计算含量，并采用药典方法即高氯酸电位滴定法测定其含量。结果见表3。

表3 门冬氨酸含量测定

3 讨论

门冬氨酸现有的含量测定方法为高氯酸电位滴定法，操作步骤多、程序繁杂、结果精密度不高。苯异硫氰酸苯酯衍生产物单一、稳定，可形成一个稳定的苯乙内酰硫脲(PTH)衍生物，即PTH-门冬氨酸，冻干的衍生物在20℃可贮存1个月，色谱响应值无明显变化;但由于样品的制备较烦琐，需预先去除剩余试剂，且存在于样品中的痕量异硫氰酸苯酯试剂也会缩短分析柱的寿命。

本试验先后考察了不同的预处理方法与流动相，选用流动相为A 12．5 mmol/L磷酸钠溶液(用磷酸调pH至6．8)、B乙腈-水(80∶20)进行梯度洗脱，经紫外扫描验证在254 nm波长处有最大吸收，且色谱峰分离效果良好。方法学考察结果表明，采用异硫氰酸苯酯柱前衍生化测定门冬氨酸的含量，稳定性好、精密度高、结果可靠、专属性强，可更好地控制产品质量。

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