石蜡切片在中药制片中注意事项及方法改良

★ 邹江斌 卢建中 张娟娟 (江西中医学院 南昌330004)

显微鉴定是中药材四大传统鉴定方法之一。制作完整、均匀而薄的组织切片是确保科研工作者能够准确清晰看清组织构造，从而辨别药材真伪的前提条件。石蜡切片具有简单易行，切片效果好，可以永久保存，普遍药材都适用等优点从而被广泛应用。由于实验材料，试剂及方法等因素的影响，只要实验过程中某一过程处理不当都可以导致实验失败，在实际操作中还得对实验各个环节加以注意。石蜡切片过程依次包括软化(干硬药材)、取材、固定、洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋，切片，贴片与烤片、脱蜡、复水、染色、脱水、透明、封片等。本文总结了石蜡切片的某些过程的方法学改良和注意事项。

1 软化

软化是指对干、硬药材的前处理。实际工作中由于季节及地域的限制，我们很难及时弄到新鲜药材，因此我们常常采用干燥药材，这时我们就要对药材进行软化。对于一些硬度不是很大的药材我们可以通过水浸泡，而对于药材硬度较大的药材就要通过其它方法处理。据宗希明［1］报道，部分干燥药材采用适当溶剂软化可以得到良好效果。如一般质地软，含薄壁组织较多，木化组织较少的材料可选用15% －20%甘油、50% －70%乙醇、甘油－乙醇溶液、冰乙酸－乙醇溶液浸泡软化。质地硬，组织排列密度大，含纤维、石细胞、木栓化、木质化组织较多的材料可选用15% －20%甘油、甘油－乙醇溶液、18%氨水溶液浸泡软化。对于十分坚硬，富含石细抱，纤维素性和木质化的材料，可选用36%氨水溶液，置于温箱中(30 －40℃)浸泡软化。全部木栓化和本质化的木材类，可用37%氢氟酸浸泡软化。其后程莲银［2］举了10 种有代表性的干硬药材的软化处理方法。娄玉霞［3］通过单因素考察发现软化方法，软化温度，软时间对药材软化效果存在影响。

2 取材

取材过程主要涉及到取材部位和取材大小。取材部位一般根据实验而定，大小要适当:根及茎类一般直径≤5mm，切取成5 －10mm 小段，对于稍粗药材可以将其对剖成1/2或1/4 大小;叶类取过中脉处，与中脉成直角切成宽2 －5mm，长5 －8mm 小片。取材过大，固定液及石蜡难以进入，同时水分也不易脱掉。

3 固定

对于新鲜药材必须要经过固定，其目的在于杀死及固定细胞，从而使组织保持原来的结构。目前使用较多的为混合固定液:FAA 固定液、卡诺氏固定液、纳瓦兴氏固定液、波因固定液、里根规定液、酒精－福尔马林液、铬酸－醋酸固定液铬酸、铬酸－饿酸－醋酸固定液。其中FAA 固定液最为常用，由50%或者70% 酒精90mL、冰醋酸5mL 和福尔马林5mL 配置而成［4］。由于它既可以作为固定液由可以用于保存药材，因此固定时间没有限制。固定液的体积应为组织总体积的10 －15 倍［5］。

4 冲洗、脱水、透明及融蜡过程

固定之后，药材应置于流水中冲洗数小时，避免药材中残留的固定液直接影响染色效果。脱水过程是整个石蜡切片中最为重要的环节，药材中水分是否被完全脱离直接影响到后面透明及融蜡过程中二甲苯及石蜡进入，因此实验过程中要不定期更换脱水液以保证脱水液的浓度。脱水液一般从30%浓度开始，并且级别差尽量要小，避免药材皱缩。同时我们要在脱水过程中注意控制脱水时间，否则会出现药材过度硬化，直接影响后面的切片过程，每级脱水时间一般控制在10 －20 分钟。如果当天不能处理完脱水，透明过程，则放置70%乙醇中过夜。透明采取逐步加二甲苯法(1/2 无水乙醇+1/2 二甲苯、纯二甲苯2 次)，透明要充分，直到完全透明为止，时间不可过长，否则材料易脆。融蜡过程时间较长，一般2 －3 天，期间我们要不停加入蜡屑，直至不在溶解为止，此过程在水浴锅中进行，温度为40℃。然后将药材取出放入已经完全熔融的纯蜡中2 次，每次时间为2 －3 小时，该过程在恒温箱中进行，温度高于石蜡熔点1 －2℃。

据马国祥等［6］研究发现:利用聚乙二醇代替石蜡制石斛切片效果良好，解决了用石蜡切片时不足。徐珞珊等［7］利用加温方法促使脱水、透明及石蜡过程在4 －5 小时完成。据报道［8］“生物快速处理仪”处理各级脱水、透明的时间只需15 －30 分钟，可在较短的时间内完成切片的全过程。

5 包埋

包埋前需要准备好纸盒，其大小一般为5cm ×2cm ×1.5cm。将药材连同熔融石蜡迅速从恒温箱中取出倒入包埋盒中，用解剖针将药材立于盒内不倒再撤去。如果药材周围有气泡存在，将解剖针放在酒精灯上灼烧片刻，迅速插向气泡致其排出。如果想石蜡能迅速冷却，可以将纸盒放入冰水混合物中，同时可以防止压块中间凹陷出现空洞。邓兴峰［9］报道了石蜡切片法中细长或薄片状材料的包埋方法:先在包埋纸盒底部形成约1mm 厚的软蜡层;待软蜡层凝固前，再向纸盒中倒满熔蜡，然后迅速将渗好蜡的材料直立地放入熔蜡中，并将材料轻压在纸盒底部的软蜡层上。

6 切片与粘片

切片时厚度的把握对能否形成连续蜡带至关重要，一般控制在9 －10μm，太厚则切片容易卷缩，不能形成蜡带。同时调整好刀片与蜡块角度，一般刀刃与蜡块表面呈5°，以保证切下来的药材为横切面，否则影响实验结果。石蜡切片法中传统的贴片方法主要有2 种:一种是用烫片台法，一种是温水捞取法。但是在但在少量切片时可直接在涂有甘油蛋白的载玻片上加少量蒸馏水，将切片放在上面，载玻片直接在酒精灯上加温，至切片完全展开为止，倒去多余水分入温箱中烤干。注意贴片位置为载玻片两对角线交点处，以保证制片科学美观。罗艳蕊等［10］通过实验，摸索得到一种快速，展片效果好的贴片方法:蜡带在放入温水之前，先放入事先配置好的浓度为45% －50%乙醇中片刻，然后再放入温水中。以上贴片都在载玻片上涂有粘合剂，据任成林［11］经验介绍不使用粘合剂同样可以制作质量稳定，优片率高的切片:其方法为一定要保证载玻片干净，切片不要太厚，捞片时防止切片皱褶和含有气泡，及时除去载玻片上水分，迅速放入横温箱中，横温箱的温度应高于所用石蜡熔点1 －2℃，烤片4 －6 小时。后来王宝荣等［12］人同样报道了类似方法。

7 脱蜡与染色

切片染色时脱蜡一定要彻底，否则会导致不易着色，在同一切片上出现着色深浅不一。当载玻片上无明显蜡块且清晰透明即可。如果想加快脱蜡时间，可以将二甲苯放在60℃恒温箱中加温30 分钟。，然后再将烘好的切片放入二甲苯中，这样不仅缩短了脱蜡时间，还降低了切片因脱蜡时间过长导致掉片［13］。通常药材组织切片所用的染色剂为番红(50%乙醇配置，浓度1%)，固绿或亮绿(乙醇配置，浓度0.5%)。番红可以将木质化组织染成红色，快绿或亮绿可以将细胞壁染成绿色。番红染色通常要24 小时以上，当切片放置50%乙醇中洗脱，不完全褪色即可。固绿染色时间的把握对整体切片成败起着决定性作用。染色时间太长，则组织会被染得太绿不利于观察，如果太短，则组织着不上色，因此一般控制在30 －40 秒。染好的切片应妥善保存，更应避免日光照射，否则切片容易褪色。

8 中性树胶封藏

切片封藏前要配置好中性树胶，其方法为用二甲苯稀释中性树胶，用玻棒蘸取中性树胶，当树胶成滴状缓慢流下即可。封片时要注意不要产生气泡，如果产生气泡则用灼烧炽热的解剖针从盖玻片一侧将气泡引出。封好片后，放于37℃温箱烘干，永久保存。

9 小结

常规的石蜡切片步骤并不复杂，但是想要做出一张优秀的石蜡切片，需要我们在实验过程中严格控制好每一环节，因为其中的每一个环节都是相互关联、一环套一环的，任何一个环节出错，都会影响最终制片的质量。同时我们还需要根据不同药材，适当改进，从而才能得到我们所需要的切片。

［1］宗希明，韩树盛.石蜡切片中干硬中药材软化处理方法［J］.佳木斯医学院学报，1994，17(1):34 －35.

［2］程莲银.干、硬中药材作石蜡切片的技术处理方法［J］. 中国药师，2000，3(6):374.

［3］娄玉霞，蒋巧凤.干燥中药材石蜡制片的方法研究［J］.河南中医药学刊，1999，14(1):26 －27.

［4］李正理.植物制片学［M］.北京:科学出版社，1973:9 －18.

［5］侯春春，徐水.浅析影响石蜡切片质量的关键因素［J］.中国农学通报，2009，25(23):94 －98.

［6］徐珞珊，马国祥，陈世忠，等.聚乙二醇制作植物切片方法［J］.中国中药杂志，1995，20(5):264 －265.

［7］李卿洲. 药材的快速石蜡切片法简介［J］. 药学学报，1966，13(8):610 －612.

［8］刘惠娟，李萍，徐路珊.制作中药材石蜡切片的几点方法［J］. 中药材，1997，20(5):269 －270.

［9］郑兴峰.石蜡切片法中细长或薄片状材料的包埋［J］. 生物学杂志，2003，(4):41 －43.

［10］罗艳蕊，孔翔会，李卫国，等.石蜡切片贴片法的改良［J］. 生物学杂志，2002，19(6):38.

［11］任成林.常规石蜡切片不用粘贴剂［J］.中国兽医杂志，1994，20(1):38 －39.

［12］金延明王宝荣.植物组织切片不使用粘贴剂的方法［J］.中国中药杂志，1995，20(3):140.

［13］郑燕璇，王晓鸿，苟新敏.石蜡切片脱蜡方式的比较［J］.中国实用医药，2009，20(14):211.