三脉紫菀总皂苷的提取工艺研究

★ 刘爱红 袁金斌 刘荣华 钟国跃 郑燕梅 任刚 (.南昌大学分析测试中心 南昌0047;.江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 南昌0004;.江西中医学院中药资源与民族药研究中心 南昌0004)

三脉紫菀(Aster ageratoidesTurcz.)为菊科(Compositae)紫菀属植物，具有清热解毒、祛痰镇咳的功效［1］。在江西民间三脉紫菀是治疗咳喘病的有效单方，并在当地因此得名“换肺草”。1971 年全国攻克老年慢性气管炎工作会议上，三脉紫菀被定为全国18 个有效方剂之一。紫菀属植物的化学成分主要包括黄酮类(地上部分)和皂苷类(地下部分)，此外还含有三萜、倍半萜、二萜、单萜、甾醇、脂肪酸和肽类等成分［2］。其中根部的三萜皂苷类是紫菀属特征性成分，也是三脉紫菀祛痰作用的主要药效物质基础之一［2］。前期研究中，笔者建立了三脉紫菀总黄酮的提取工艺［3］，本研究继续对总皂苷的提取工艺进行了研究，以期为三脉紫菀总皂苷的进一步化学、药理研究打下基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-2550 型紫外分光光度计(日本Shimadzu公司)、R -210 型旋转蒸发仪(瑞士Buchi 公司)、Sartorious BT 124S 型万分之一天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)、GZX -9070MBE 型数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司)、KQ-300DB 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料

三脉紫菀于2010 年采于江西省吉安市永新县郊外，经江西中医药大学刘荣华教授鉴定为菊科紫菀属植物三脉紫菀。齐墩果酸标准品购自南昌市药品检验所(批号:110709 -201104)。香兰素、浓硫酸为国药集团化学试剂有限公司产品，甲醇、乙醇、冰醋酸等有机溶剂均为上海振兴化工一厂产品，蒸馏水自制。

2 方法与结果

2.1 三脉紫菀总皂苷含量测定

2.1.1 药材的处理

取三脉紫菀根除尽尘土，阴干，粉碎过40 目筛，密封保存备用。

2.1.2 标准溶液的配制

精确称取齐墩果酸标准品11.0mg，乙醇溶解并定容至50mL，得0.22mg·mL-1的齐墩果酸标准品母液。

2.1.3 测定波长的选择

称取“2.1.1”项制备的药材粉末1.5g，置于回流装置，加入30mL75%乙醇，于70℃浸提2 小时，过滤，滤液转移至50mL 容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀，得样品溶液。

分别吸取0.2mL 齐墩果酸标准品溶液和样品溶液于具塞试管中，挥干溶剂，准确加入新配置的5%香草醛-冰醋酸0.2mL，再加入72%的浓硫酸3mL，振摇。于60℃水浴中加热，20 分钟后取出，流水冷却至室温。标准品管以未加标准品的相同试剂作空白，样品管以未加显色溶液的样品溶液为空白，在400 -700nm 波长范围内进行扫描，得紫外吸收光谱图(见图1)。图上可见，标准品及样品在536nm 处有共同的最大吸收波长，因此选择536nm为测定波长。

图1 三脉紫菀提取物与齐墩果酸的紫外-可见光吸收图谱

2.1.4 标准曲线的制备

精确吸取上述齐墩果酸母液0.5，0.7，0.9，1.0，1.1mL，分别加入具塞试管中挥干溶剂，加入新配置的香草醛-冰乙酸溶液0.2mL，再加入72%的浓硫酸溶液3mL，振摇。在60℃水浴中加热20 分钟取出，流水冷却至室温。在536nm 处测定各试管中溶液的吸光度。以齐墩果酸的质量(X)为横坐标，吸光值(Y)为纵坐标绘制标准曲线，以最小二法线性回归，得线性回归方程:Y =1.9416X +0.1392，相关系数为r=0.9989。

2.1.5 供试品溶液的制备及测定

准确称取“2.1.1”项制备的药材粉末5g 干燥至恒重，按正交设计的提取条件回流提取。提取液过滤后减压浓缩，浸膏用适量乙醇溶解，过滤，滤液移至50mL 容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀即得待测样品溶液。按“2.1.4”项的操作方法测定吸光度，根据标准曲线方程计算总皂苷含量。

2.1.6 精密度实验

取同一供试品溶液，在536nm 处重复测定六次，根据标准曲线方程得到总皂苷含量，结果表明精密度良好，RSD 为0.23%(n=6)。

2.1.7 稳定性考察

取同一供试品溶液，分别于0，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，8 小时分别进行测定，计算RSD 为2.86%(n =9)，表明总皂苷含量在8 小时内基本稳定。

2.1.8 重现性实验

精密称取同一批次三脉紫菀药材粉末5 份，按照“2.1.5”项下方法制备样品溶液，照“2.1.4”项下的操作方法测定吸光度，结果表明该方法重复性良好，RSD 为1.30%(n=5)。

2.1.9 加样回收率实验

准确称取已知含量的三脉紫菀药材粉末0.5g，加入齐墩果酸适量，“2.1.5”项下方法制备样品溶液，照“2.1.4”项下的操作方法测定吸光度，计算回收率。结果表明，平均回收率为97.08%，RSD 为1.22%，说明该方法测得的结果准确。

2.2 提取工艺研究

2.2.1 正交实验设计

选择乙醇体积浓度(A)、提取时间(B)、料液比(C)、提取次数(D)4 个因素为考察因素，每个因素3 个水平，以L9(34)正交设计表安排试验，以三脉紫菀中总皂苷含量为评价指标。因素水平表见表1。

表1 实验因素水平表

2.2.2 正交实验结果

分别精密称取三脉紫菀药材粉末50g，按照正交表的设计进行实验，用紫外分光光度法测定总皂苷含量，并进行方差分析。结果见表2、3。根据表2中的极差R 值分析可知，各个因素对三脉紫菀总皂苷提取效果影响大小依次为A ＞C ＞D ＞B。方差分析结果(如表3)表明，乙醇浓度为影响总皂苷提取的显著因素，而提取次数、料液比及提取时间对总皂苷的提取没有显著影响。以上分析综合经济环保角度考虑，确定最佳提取工艺条件为A1C1D1B1，即50%乙醇、料液比为1∶6、回流提取2 次，每次1 小时。

表2 正交实验结果

表3 方差分析结果

2.2.3 最佳提取工艺的验证准确称取三脉紫菀根粉末5.0g，共3 份。按上述最佳提取工艺:即三脉紫菀药材加6 倍量50%乙醇，回流提取2 次，1 小时/次。提取液浓缩定容至50mL 容量瓶中，取样，显色测定总皂苷含量。结果总皂苷的平均含量为75.23mg·g-1，总皂苷提取率为1.51%，RSD =1.56%(n =3)，说明此工艺条件稳定、可行。

3 讨论

前人对三脉紫菀的化学成分研究表明，齐墩果烷型三萜皂苷是其皂苷的主要存在形式［4-5］。鉴于此，本研究采用了齐墩果酸作为对照品。在选择显色剂方面，我们曾尝试用香草醛-冰醋酸-浓硫酸法和香草醛-冰醋酸-高氯酸法分别对三脉紫菀总皂苷显色，多次实验表明，前者显色更稳定，且样品与对照品的最大吸收波长对应性好。因此本研究采用了香草醛-冰醋酸-浓硫酸显色法。

在建立三脉紫菀总皂苷含量测定方法的基础上，采用正交试验对总皂苷的提取工艺进行了筛选。结果表明50%乙醇、料液比1∶6、回流提取2 次、1小时/次，所得总皂苷含量为75.23mg/g，RSD =1.56%(n=3)。该工艺简便、实用，可以为三脉紫菀总皂苷的工业化生产提供参考。

［1］郑朝宗.浙江植物志(第6 卷)［M］.杭州:浙江科学技术出版社，

1993:238.

［2］刘可越，赵昱波，刘海军，等.紫菀属植物化学成分与生物活性研究进展［J］.现代药物与临床，2009，24(5):276 -278.

［3］周志望，黄慧莲，邵峰，等.三脉紫菀总黄酮的提取纯化工艺优选［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(18):7 -10.

［4］Yan F L，Wang A X，Jia Z J. Pentacyclic triterpenoids from Aster ageratoides var. pilosus［J］.Pharmazie，2004，59(11):882 -884.

［5］Sakai K，Nagao T，Okabe H. Triterpenoid saponins from the ground part of Aster ageratoides var. ovatus［J］. Phytochemistry，1999，51(2):309 -318.