华仁杏SSR标记的筛选与评价

秦 玥 ，刘梦培 ，傅大立 ,2，朱高浦 ，赵 罕

（1.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；2.北京林业大学，北京 100083）

华仁杏Armeniaca cathayanaD. L. Fuet al.属于蔷薇科Rosaceae李亚科Subfam. Prunoideae杏属ArmeniacaScop.，是2010年傅大立等发表的我国杏属一新种[1]。华仁杏是我国重要的木本粮食与油料兼用树种，具有果核薄、杏仁大、无苦味、含油率高、油质上乘、抗性强等优良特性。华仁杏种质资源丰富，栽培品种较多，但其相关的分子标记研究鲜见报道，新种发表至今，仅有极少数学者就其不同品种与杂交种进行了分子标记研究[2-5]。

研究华仁杏的SSR引物，对寻求科学准确的种质鉴定技术，解决其生产中存在的品种混杂、同名异物现象具有重要意义。SSR分子标记是近几年发展起来的利用范围较广的分子标记技术，具有多态性高、重复性好、共显性遗传、数量丰富、对基因组覆盖性高等优势[6-8]。目前，SSR分子标记技术以其独特的优势在遗传多样性分析[9-10]、遗传连锁图谱构建[11-12]、基因定位[13]等研究中均发挥了重要作用。由于华仁杏为近年发现的新种，目前适用于华仁杏研究的SSR引物未见报道，无法满足其品种鉴别和起源演化等研究的需要，因此，加快开发华仁杏SSR引物筛选工作显得尤为重要。关于其它物种的研究表明[14-16]，SSR分子标记在属内不同种间具有一定的通用性，甚至在不同属间也具有一定的通用性。因此对近缘物种已开发的SSR引物进行筛选，也是一条获取SSR引物的重要途径。

本研究中利用SSR分子标记技术，以华仁杏为供试材料，筛选适合的多态性引物，旨在为华仁杏遗传资源的进一步评价研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试华仁杏材料均采集于中国林业科学研究院张家口实验基地，共60份（见表1）。SSR引物均由上海英俊公司合成，试验中所用试剂均购于Takara公司。

表1 供试的华仁杏品种Table 1 The tested cultivars of Armeniaca cathayana

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

取60份华仁杏幼嫩健康的叶片，利用试剂盒法提取基因组DNA，并用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其质量和浓度。

1.2.2 PCR扩增

PCR反应体系总体积20 μL，其中Premix Taq Version 2.0（Loading dye mix） 9 μL，上下游引物各1 μL（10 μmoL/L）、DNA模板1.5 μL（20 mg/L），ddH2O 7.5 μL。循环体系 94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 扩增产物检测

扩增产物在110 V电压下，利用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，40 min后取出在全自动紫外与可见分析装置中拍照。

具有清晰条带的产物在6%聚丙烯酰胺凝胶（PAG）上电泳，200 V电压，电泳2 h后，将胶取出放入之前配置好的染色液中染色。染色液的配制方法：10 mL 1 moL/L 的NaCl溶液中加入10 μL的10 000×Gelred原液，再用1×TBE定容到100 mL）。30 min后取出拍照[17]。

1.2.4 数据采集与统计分析

将电泳图谱上同一位置清晰出现的条带记为1，没有条带记为0，记录过程中，统计主要带型，忽略弱杂带型，构建SSR引物扩增结果的数据库。统计每对SSR引物PCR扩增出的不同等位位点数，计算每个SSR位点的多态性信息含量指数（PIC），，其中Pi为某个SSR位点的第i个等位变异出现频率占该位点全部等位变异出现频率的比率。并用PopGene软件计算杂合度、Shannon指数等信息。

2 结果与分析

2.1 SSR引物筛选结果

利用8份华仁杏样品进行65对李亚科SSR引物的筛选，其中31对引物多态性较高、稳定性较好并且分辨率较高。利用这31对SSR引物对60份华仁杏材料进行扩增，得到产物片段大小在67～394 bp之间，部分电泳结果如图1与图2所示，筛选出的31对引物的信息见表2。

2.2 引物SSR位点分析

利用筛选出的31对SSR引物在60个华仁杏样品中检测到138个等位基因位点，每对引物可检测2～7个等位位点，平均等位位点数为4.5个。其中，以引物aprigms20、aprigms24和BPPCT030检测的等位基因最多。平均多态性信息含量指数（PIC）为0.72，变化范围为0.28～0.90，以引物aprigms18的值最高，引物Pchgms2的值最低。

利用PopGene软件分析31对引物对60份华仁杏材料的检测结果，结果见表3。从表3可以看出：平均观测杂合度为0.533 6；引物BPPCT002的值最高，为0.867 9；引物Pchgms2的最低，为0.050 0。平均期望杂合度为0.580 8；引物BPPCT030的值最高，为0.785 9；引物Pchgms2的最低，为0.065 4。Nei指数（h）的分布范围在0.064 9～0.779 1之间，平均每个位点的h值为0.575 4。平均每个位点的Shannon信息指数（I）值为0.646 5；引物BPPCT030的I值最高，为1.674 6；引物Pchgms2的值最低，为0.164 9。

图1 引物BPPCT030的部分扩增产物的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig.1 6% PAGE gel electrophoresis of part of ampli fied products with primer BPPCT030

图2 引物Pchgms2的部分扩增产物的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig.2 6% PAGE gel electrophoresis of part of ampli fied products with primer Pchgms2

表2 筛选出的31对SSR引物对60份供试材料的扩增结果Table 2 Amplification result of 60 samples by using 31 pairs of primers

表3 华仁杏引物的SSR扩增统计结果和基因多样性分析Table 3 SSR amplification results of primers and analysis of genetic diversity in Armeniaca cathayana

3 讨论与结论

本研究以华仁杏不同品种作为试验材料，从65对已公开发表的SSR引物中筛选出31对引物，可以扩增出清晰的条带。该31对引物中既包括杏属引物，也包括李属及少量其它蔷薇科引物，由此可见，SSR标记具有较好的通用性。

利用31对引物在60份华仁杏材料中进行PCR扩增，共检测到138个等位基因位点，每对引物可检测2～7个等位位点，其中有3对引物等位位点数达到7。较高的多态性显示了SSR标记具有较高的应用价值，同时也反映了供试材料在该位点存在较大的遗传差异[18]。

PIC值、杂合度、Nei’s基因多样性、Shannon信息指数均是描述引物多态性的指标。计算每对引物的PIC值，最高可达0.9，平均值也高达0.72，较玉米[19]、辣椒[20]、甜瓜[21]等其它多数物种偏高。一般认为当PIC＞0.5时，该引物为高度多态性信息引物；当0.25＜PIC＜0.5时，为中度多态性信息引物；当PIC＜0.25时，为低度多态性信息引物[22]。本研究中所得平均期望杂合度及观测杂合度分别为0.533 6及0.580 8，较Fatemeh等[23]和张淑青等[24]试验所得值0.628和0.68偏低。

综合几个指标，31对引物中鉴别能力最强的2对引物为BPPCT030和aprigms18，最弱的2对引物为Pchgms2和aprigms23。

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