根癌农杆菌转化单子叶植物的研究进展与对策

张洁 周岩

（河南科技学院生命科技学院，新乡 453003）

自1983年成功获得第一例农杆菌介导的转基因烟草以来，有关农杆菌介导的基因转移的应用研究逐步发展成为植物基因工程领域的研究热点，通过农杆菌介导法转化植物的研究也日益广泛和深入。农杆菌介导法具有转化植物受体，操作易行，经济简便，可插入大片段DNA，整合于基因组上的外源基因拷贝数少且重排程度低，技术仪器要求低，转化效率高等颇多优点。

由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，利用农杆菌介导法对单子叶植物进行遗传转化的研究因此受到限制。Portrykus［1］曾认为农杆菌转化单子叶植物是不可能的。禾谷科作物如水稻、小麦、玉米都是单子叶植物，是人类重要的粮食作物，利用基因工程技术对该类植物的研究具有十分重要的价值。近年来，随着农杆菌介导法转化机制和影响因素的进一步研究以及转化方法的不断完善，农杆菌介导法已逐步发展成为大部分双子叶植物和一部分单子叶植物遗传转化的主流方法，以及植物基因工程中不可或缺的研究工具，具有极大的应用价值。本文是针对近年来根癌农杆菌转化单子叶植物的研究进展以及存在的问题与提高转化效率的对策进行了综述。

1 农杆菌介导法的机理

农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，含有一种与肿瘤诱导相关的Ti质粒，其上含有可转移DNA （T-DNA ）区、毒性区（Vir区）、结合区（Con区）和复制起始区（Ori区）4个部分。其中，T-DNA 是能够转移至植物细胞内，并与植物基因组整合而得以表达的区段，其左右各有 25 bp 的重复序列边界。因此，可以通过将外源基因插入T-DNA 区段上以实现外源目的基因的转移以及在植物细胞中的表达，从而改变植物的遗传性状。

当植物受到伤害时，会分泌释放含有酚类化合物的物质，这些酚类化合物可以促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞的表面，还可以诱导 VirA 基因的表达，VirA 基因经磷酸化后便可激活作为转录活化因子的 VirG 蛋白，从而与多个 Vir 基因的产物结合，对 T-DNA 开始从右边界向左边界进行切割，产生一条 T-DNA 单链，T-DNA 单链可与VirD2 、VirE2 蛋白结合，最终形成 T-复合体。T-复合体随之被释放到农杆菌细胞外，经由 VirB 蛋白在植物细胞壁上形成的通道进入植物细胞内，并在 VirD2 和 VirE2 核定位信号的引导下，被转运蛋白识别通过核孔进入到细胞核内，使T-DNA插入植物的核染色体中，这便完成了 T-DNA 由农杆菌转移到植物细胞核并进行整合的过程。

由于农杆菌 Ti 质粒具有天然的转移 DNA 特性，根癌农杆菌介导法成为目前植物转基因技术中最经济简单、研究最深入、发展最成熟的转基因方法。

2 根癌农杆菌转化单子叶植物的研究进展

1984年，Hernalstenns［2］通过农杆菌介导法成功转化单子叶植物石刁柏的应用报道，首次证实了根癌农杆菌是可以转化单子叶植物的，并为根癌农杆菌转化单子叶植物的研究提供了理论依据和技术支撑，为近年来单子叶植物的转化研究的不断发展奠定了坚实基础。目前，通过农杆菌介导转化成功的单子叶植物涉及到禾本科、百合科、石蒜科等，并取得了丰硕成果。

2.1 小麦

第一株转基因小麦是在1992年通过基因枪法获得的，一直以来，基因枪法占据着小麦转基因手段的重要位置［3］；其次是农杆菌介导法。通过农杆菌介导获得的第一株转基因小麦诞生于1997年，Cheng等［4］以刚剥离的幼胚、预培养的幼胚和幼胚愈伤组织为受体材料，利用 35S 启动子和 HSP70 内含子构建的农杆菌表达载体在小麦上得到了高达4.3%的转化频率。随后，人们对农杆菌介导转化小麦的研究不断广泛和深入。由于小麦不是农杆菌的天然受体，其基因组相对较大，遗传背景复杂，基因型依赖性较强，因而，是转化难度较大的单子叶植物之一。因此，转化效率还较低。通过农杆菌介导法获得的转基因小麦也较少。但随着转基因技术的不断发展，农杆菌介导转化小麦的研究日益成熟，通过农杆菌介导法成功将诸多有应用价值的优良外源基因转入小麦的相关报道日趋丰富。

郭丽等［5］采用农杆菌介导的遗传转化技术，以小麦成熟胚为转化受体，建立了小麦转化体系，对转化再生植株进行报告基因 GUS 的 PCR 检测结果表明供试3株小麦的 PCR 均为阳性，转基因植株的 GUS 活性也明显高于对照。刘香利等［6］以小麦绵阳 19 和洛阳 8716 幼胚愈伤组织为受体材料，利用农杆菌介导法将小麦高分子量麦谷蛋白亚基 1Bx14 基因转入其中，并经潮霉素抗性筛选、PCR 和 PCRSouthern 杂交检测，获得平均转化率为 0.61%。石珍源等［7］利用农杆菌菌系 C58C1 将 GUS 基因和 npt Ⅱ 基因转入 18 个普通小麦经破碎处理的大龄幼胚中，经 PCR 检测，获得了转基因植株。张月婷等［8］以扬麦 158 和华麦 13 幼胚为受体材料，建立了通过农杆菌介导法将 ACE-D2 基因导入小麦的遗传转化体系，获得的 T0 和 T1 代转化植株，经 PCR 分析鉴定表明，外源基因已经整合到小麦基因组中。

2.2 玉米

玉米是世界重要的三大粮食作物之一，也是一种优质饲料，在畜牧业中占据着举足轻重的地位，亦是工业生产淀粉、酒精等产品的主要原料。因此，全世界对玉米的需求量呈上升趋势，如何快速提高玉米的产量也成为迫切需要解决的问题。近年来，转基因技术与传统育种的相互结合，促进了玉米遗传改良研究的深入发展，而且也开辟了获得玉米种质资源的一条新途径。第一株通过农杆菌介导法获得的转基因玉米诞生于1996年，Ishida 等［9］在前人探索与研究的基础上，利用农杆菌 LBA4404 转化玉米自交系 A188 幼胚，获得了转基因玉米，且转化率达5%-30%，并且证明了外源基因的成功整合、表达以及稳定遗传。该研究在一定程度上充分证实了玉米通过农杆菌介导进行遗传转化的可行性，并为今后的研究提供了可靠的科学依据。

孙传波等［10］将抗草甘膦 EPSPS 基因通过农杆菌介导转入玉米自交系郑 58 的茎尖中，经 PCR 检测，7 株转化植株呈阳性，转化率达7.14%，初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中。刘建波［11］利用中间载体 pGM-T-RP5 和 pGM-T-AGPL，将水稻胚乳特异型启动子 RP5 和玉米合成关键酶基因 AGPL 定向连接到表达载体 pCAMBIA3301 上，构建表达载体 pRP5-AGPL，通过农杆菌介导法对玉米自交系 Y9812 幼胚进行转化，经 PCR 分子检测获得 17 株阳性植株。李晓丽等［12］以玉米自交系齐 319 茎尖分生组织为受体，采用农杆菌介导法，将玉米胚乳特异启动子基因 15 kD β-Zein 驱动的大豆铁蛋白 ferritin 基因转入玉米，共筛选出 272 株除草剂抗性植株，其中 108 株 PCR 检测呈阳性，转化率达3.6%，初步判断外源基因已转入玉米基因组中。葛敏等［13］将 As/Ds 双元表达载体（包含抗虫Cry1 Ab/Ac基因和 gfp 报告基因等）通过农杆菌介导法转入玉米自交系 H99 幼胚愈伤组织中，经 PCR 检测 8 株转化植株目的基因已整合且有效表达，转化效率达7%。

2.3 水稻

水稻作为主要的粮食作物之一，其产量与品质的提高对于解决全球人口粮食问题以及提升人类生活质量都具有重要意义。在传统育种的基础上，分子生物技术的快速发展加速了水稻的遗传改良进程。近20年来，水稻遗传转化从起初的完全否定、认为难以转化到能够转化的可行性断定结论，再从低频转化、对转化体系的不断优化研究到高频转化，以及实现大量优质外源基因的成功转化整合。在这一过程中，水稻遗传转化研究取得了突破性的进展以及丰硕的成果。

农杆菌介导的水稻遗传转化开始于Baba［14］在1986年的研究，他通过 PEG 的介导将农杆菌原生质球与水稻原生质体进行融合，获得的愈伤组织可以合成胭脂碱。随后，大量有关水稻遗传转化的研究开始进行，并不断地深入。直至1994年，Hiei 等［15］首次实现了对粳稻的转化，转化率高达 28.6%，并从分子水平上证明了外源基因已经插入到水稻基因组中，且可以稳定地遗传，此研究取得了重大的技术突破，为近 20 年来水稻的研究发展奠定了坚实的试验依据和理论基础。吴振映等［16］利用农杆菌介导法将编码Bt毒性蛋白的 cry2A*基因转入受体水稻品种镇稻 88 中，PCR 和 AGE 分析结果表明，外源基因 cry2A*已成功整合到镇稻 88 基因组内，田间试验结果显示转基因阳性植株有明显的抗虫效果。王春萍等［17］通过农杆菌 LBA4404 将目的基因肌醇多磷酸盐激酶基因 ThIPK2 转入籼稻科恢 675 中，并建立了快速的遗传转化体系，经 PCR 检测证实外源基因已成功转入到科恢 675 中。周融希［18］通过农杆菌介导法将从小麦中克隆得到的小麦颗粒结合型淀粉合成酶基因 GBSSⅠ 转入玉米自交系 Y423 体细胞胚胎中，获得了转基因植株，经 PCR 检测有 35 株呈阳性，阳性率为 15%。

3 影响根癌农杆菌转化单子叶植物的问题

从根癌农杆菌介导转化植物细胞的机理与过程中可看出，农杆菌及单子叶植物这两个方面的因素是决定根癌农杆菌转化单子叶植物成功与否的关键。

3.1 根癌农杆菌的相关因素

根癌农杆菌对植物细胞的吸附是转化的首要步骤。选择合适的农杆菌菌株与高效的表达载体是农杆菌转化中至关重要的因素。农杆菌的吸附数目越多转化成功的可能性就越高，其与农杆菌本身的性质有密切关系。有研究表明，胭脂碱型农杆菌比章鱼碱性农杆菌更易于附着在禾谷类细胞的表面［19］。

易自力［20］对供试水稻进行平均瞬时表达率和稳定表达率分析发现，EH105 分别为51.5%和28.4%，LBA4404分别为44.3%和22.6%，AGL1 分别为 39.8% 和 17.3%。可见，EH105 的转化效果最好，LBA4404 的次之，AGLI 的最差。该试验表明，不同的农杆菌菌株对水稻愈伤组织的转化能力不同。刘香利［6］分别使用农杆菌菌株 EHA105 和 LBA4404 侵染两个小麦品种的幼胚愈伤组织，结果发现，对于菌株 EHA105，两个小麦品种最佳侵染条件为农杆菌侵染浓度为 OD600=0.8，侵染时间为 30 min；对于 LBA4404，绵阳 19 和洛阳 8716 的侵染最佳条件分别为 OD600=1.0，侵染 30 min 和 OD600=0.8，侵染 60 min。通过 gus 基因瞬时表达检测对转化率进行统计发现，洛阳 8716 对 LBA4404 的敏感性高于绵阳 19，EHA105 对两个品种侵染率都较高，这可能与其毒性较强有关。

3.2 单子叶植物的相关因素

3.2.1 基因型 与双子叶植物一样，单子叶植物受体品种的生理状态与遗传背景是影响农杆菌转化的重要因素。易自力［20］的研究还得到另外一个结论：不同的水稻品种对农杆菌的敏感性也是有差别的。梗稻品种台北 309 对 3 种菌株的平均瞬时表达率和稳定表达率分别为 55.5% 和 27.5%，而釉稻品种特青则分别只有 34.8% 和 18.0%。显然，台北 309 比特青更容易接受农杆菌的转化，籼稻的转化效率明显低于粳稻。这主要是由于不同的水稻品种对农杆菌侵染反应的敏感性差异及其愈伤组织的诱导和分化能力的不同等诸多因素综合影响导致的。

叶兴国等［21］对我国 35 个春小麦进行了农杆菌敏感性研究和转化研究发现，品种新春 9 号和 PM97034 两个基因型对农杆菌敏感性较强且转化效率较高。王宏伟［22］在利用农杆菌对玉米自交系 R18-599 和齐 319 幼胚愈伤组织进行转化时发现，EHA105 菌株对玉米自交系齐 319 的侵染效果好于 R18-599，其平均 GUS 瞬时表达率分别为 31.2% 和 23.74%，说明基因型对玉米遗传转化效率有很大影响。李欣等［23］以 12 个优良小麦新品种为材料，研究了各品种成熟胚的再生率及其对农杆菌侵染的敏感性差异。结果显示，周麦 27 和扬麦 19 等品种成熟胚再生率比较高，适合进行成熟胚培养，周麦 18 和扬麦 15 等品种成熟胚愈伤组织对农杆菌侵染比较敏感，适合进行农杆菌转化。

3.2.2 外植体 不同的外植体意味着其细胞生长状态、生活时期、生理代谢及基因表达都存在一定程度上的差异，因而不同生理状态下的细胞对农杆菌的敏感性及农杆菌对该受体植物的感染性都不同。在农杆菌侵染受伤植物时，受伤细胞会分泌酚类化合物激活农杆菌 Ti 质粒上的毒性区，以诱导转化。有些研究者则认为单子叶植物不能被农杆菌所转化是由于不能分泌酚类化合物或者分泌量不足。但 1996 年，许东晖［24］从水稻幼穗分化期和抽穗扬花期的叶片抽提液中检测到了与乙酰丁香酮的诱导作用相似的两种酚类化合物信号分子，证实了单子叶植物含有高效诱导 Vir 基因表达的信号分子，只是这类信号分子不能在植物微管系统内运输，仅能在植物特定的发育时期和特定的部位细胞中表达产生。同时，转基因植物的再生决定于植物细胞的分化能力。因此，选择适合转化的最佳外植体对提高农杆菌侵染单子叶植物的转化效率，以及转基因植株的获得具有很大作用。王永勤等［25］研究发现，大于 10 d 龄的农大愈伤组织作为转化的起始材料，获得抗性愈伤组织率比直接剥离的幼胚作为转化受体的抗性愈伤率高 40.4%。马建华等［26］采用携带双元表达载体 PCAMBIA-1303 的根癌农杆菌菌株 AGL1，对 12 个“川农”系列小麦品种的幼胚和愈伤进行了遗传转化，GUS 瞬时表达检测结果表明，愈伤组织的瞬时转化率明显高于幼胚。这可能是由于愈伤组织的结构和生理状态更利于外源基因通过农杆菌侵染整合到受体基因组。

4 提高根癌农杆菌转化单子叶植物效率的对策

根据农杆菌介导法的转化机理，可以总结出以下几个途径是转化过程的重要因素：（1）增加农杆菌对受体植株的吸附量与相互作用；（2）对单子叶植物进行受伤处理；（3）提高能活化vir基因表达的酚类物质含量以造成对受体植物细胞的侵染；（4）加强T-DNA进入植物细胞后，对植物基因组的整合度。因而，通过这些关键步骤的改良，使T-DNA能够顺利与植物基因组进行整合并得以表达，是提高根癌农杆菌转化单子叶植物效率的有效解决方法。

4.1 添加表面活性剂

表面活性剂具有离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂，由于非离子活性剂对植物伤害性较小，毒性最弱，因而普遍应用于生物研究领域中。表面活性剂有两个主要特征：一是表面活性剂分子具有双亲结构，对有机物具有较强的亲和力；二是表面活性剂分子在较低浓度下就能吸附在两相界面上，明显降低界面张力，使高分散系统趋于稳定［27］。

表面活性剂具有增加细胞膜通透性的功能，因而在农杆菌介导的遗传转化过程中，能够增加农杆菌对植物的吸附，提高 T-DNA 从农杆菌向植物细胞转运的速度，从而获得较高的转化效率。早在Cheng［4］首次报道利用农杆菌侵染获得转基因小麦的研究中就对表面活性剂对转化的作用加以分析，认为添加适宜浓度的 Silwet 和 Pluronic F-68 对农杆菌侵染小麦以及外源基因的转移具有促进作用，而 Tween20 和 Triton X 两种表面活性剂以很低的浓度存在于共培养液中也会对受体小麦幼胚愈伤组织造成一定危害。随后，有关表面活性剂在农杆菌介导转化植物的研究越来越深入。Yang等［28］在农杆菌转化玉米幼胚愈伤组织时，在菌液中添加 0.01%-0.02% Silwet L-77，最利于对玉米幼胚进行转化。王志成等［29］对农杆菌转化水稻的方法进行了改进发现，在愈伤组织经农杆菌侵染后，再以 0.1% 表面活性剂 Tween20 的溶液进行处理可明显提高水稻愈伤组织的转化频率，也可相应增加抗性植株的再生频率。Chhabra 等［30］的研究发现，在农杆菌侵染液中加入 0.2% Tween20 能提高农杆菌转化小麦愈伤组织的转化效率，一旦高于这个浓度，转化植株的 GUS 瞬时表达率就会急剧下降。

4.2 超声波处理

超声波处理主要通过超声波的生物学效应使细胞膜经空化作用发生损伤，并且在超声波处理过程中，液相介质中会形成大量的小气泡，这些小气泡达到一定大小后就会爆裂，爆裂时产生的震动波或引起的介质快速运动足以对细胞和大分子物质造成机械损伤。因此，在组织表面和细胞膜上会形成大量的微伤口［27］，增加了农杆菌感染植物组织的深度，有利于提高转化效率。但是超声波会产生热化作用，超声在介质中传播时产生的能量会使介质的温度升高，对植物体造成伤害［27］。因此，超声波处理的时间及强度需要适宜，处理过度会对植物转化后的再生培养产生影响，处理强度和时间不足则对转化效率无明显作用效果。在研究中，对强度及时间等参数进行讨论分析，选择最佳的处理条件是超声波辅助农杆菌转化法最重要的环节。

陈立国等［31］利用农杆菌介导法将 BG2 基因和 GUS 基因导入到六倍体普通小麦山农 2618 的成熟胚愈伤组织中，研究表明运用超声波处理或真空处理可以提高转化效率，最高转化率可达 8.1%。王旭明等［32］利用超声波对发芽的小麦种子处理 20 min 后再经农杆菌侵染，侵染后的种子正常播种管理至结实，对收获的成熟种子进行卡那霉素抗性筛选，4个受试小麦品种均得到抗性后代，PCR 检测呈阳性，GUS 染色结果显示未经超声波处理的种子几乎看不到转化细胞，而经过超声波处理的种子幼苗基部的细胞转化成功，明显提高了转化效率。

4.3 添加抗氧化剂

在农杆菌转化单子叶植物时，共培养阶段愈伤组织会出现褐化现象，影响组织分化，不利于农杆菌对受体材料的转化。有些研究发现这是由于农杆菌的侵染对植物细胞造成逆境环境，植物细胞在这种逆境下会产生大量的过氧化物，细胞因此发生氧化胁迫现象。而抗氧化物可以去除细胞内的活性氧成分，保护细胞的碳水化合物、蛋白质及 DNA 等物质不被氧化，从而减少愈伤组织培养过程中的褐化，利于受体材料的再生。因此，近年来，通过添加抗氧化剂提高单子叶转化效率的研究成为热点，相关报道也较丰富。

于惠敏等［33］在利用农杆菌介导法转化济南 177 小麦的胚性愈伤组织的研究中，探讨了抗氧化剂二硫苏糖醇（DTT）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVP）对小麦转化的影响，结果发现共培养过程中添加 DTT 和 PVP 对农杆菌介导的小麦转化有一定的促进作用，当 DTT 的含量达到 0.1%-0.15%，PVP 含量达到 1.0% 时，这种促进作用最为明显，并且 DTT 对转化的促进作用明显优于 PVP，而且用量小。除了这两种抗氧化剂以外，还有半胱氨酸（Cys）、抗坏血酸（Vc）、谷胱甘肽（GSH）及 AgNO3等都可消除活性氧，其中 AgNO3的应用较为普遍。AgNO3作为一种强还原剂，对防止组织褐化具有明显的作用。王秀红等［34］在对影响农杆菌介导转化玉米相关因子的研究中发现，愈伤组织诱导率会随着培养基中添加的 AgNO3浓度的增加而升高，AgNO3的添加量以 5.0 mg/L 时的愈伤组织诱导效果最好，愈伤诱导率最高，达94.3%；在培养中还发现，AgNO3能减缓褐色物质的分泌，使培养基保持透明；筛选培养时，与未添加的 AgNO3的培养基上的胚性愈伤率相比，添加 5.0 mg/L AgNO3的培养基上胚性愈伤率增加了 37.2%，由此可见，AgNO3的添加对增加农杆菌转化玉米的转化效率有明显作用。乔定君等［35］通过农杆菌介导转化多年生黑麦草时，在预培养及共培养基中添加 0.1 mol/L 甘露醇或 5 mg/L AgNO3，添加 0.1 mol/L 甘露醇或 5 mg/L AgNO3或 0.1 mol/L 甘露醇+ 5 mg/L AgNO3，转化效率分别为对照的 1.96、1.59 和 2.95 倍。结果表明，在根癌农杆菌介导的多年生黑麦草愈伤组织遗传转化中，在预培养和共培养基中添加甘露醇或AgNO3能提高转化率，且当二者共同添加时，可显著提高转化率。

4.4 添加乙酰丁香酮

乙酰丁香酮（AS）是农杆菌毒力基因 Vir 的诱导物。单子叶植物AS的分泌量较少或是不足以完成农杆菌毒性基因的激活，因而在转化中添加适量的AS成为解决这一问题的方法之一。随着对S提高植物遗传转化率的作用机理、影响因素的研究，AS被广泛应用于植物基因工程中，尤其是在单子叶植物的遗传转化研究领域，并取得了不错成效。

Wu等［36］将携带辅助质粒（VirG、VirB和VirC基因）的农杆菌菌株AGL1，重悬于添加有 400 μmol/L AS 的CM4C液体培养基中，对四倍体硬粒小麦的新鲜幼胚进行转化，获得了 0.6%-9.7% 的转化率。并于次年，对春小麦和冬小麦新鲜幼胚进行转化，转化率达 0.3%-9.0%［37］。李明浩等［38］通过检测农杆菌转化的扬麦15和Alondra’s的幼胚愈伤组织的 gus 基因瞬时表达情况，发现AS的浓度对于小麦愈伤组织gus基因的瞬时表达率有重要影响，加入AS后的gus基因的瞬时表达率较未添加时有显著提高，并且当浓度过大时会不利于转化，AS的浓度以100 μmol/L为宜。徐书举等［39］以优良玉米自交系丹598、郑58、昌7-2、掖478 的茎尖为受体，采用农杆菌介导法将抗旱基因 SAMS 转入玉米对转化植株进行检测共获得阳性植株35株，表明基因已经整合到玉米基因组中，同时对乙酰丁香酮对转化的影响进行了研究，结果表明，当菌液中AS的添加量为100 μmol/L 时转化率达到最高，比未添加AS 的转化率高 2.6%，但当AS浓度过高时，由于对其茎尖毒性增强，转化率反而下降，可见，在农杆菌侵染液中添加一定量的AS，可以明显地提高茎尖的转化率。

5 结语

经过众多学者长期的研究，根癌农杆菌介导单子叶植物遗传转化的转化机理逐渐深入，技术方法不断创新、改良和完善，转化影响因子逐步探讨与优化，各方面都取得了长足进展。但是，与农杆菌介导双子叶植物的遗传转化研究相比，对单子叶植物在该方面的研究还有较大的差距，目前还存在较多问题，诸如转化率还不高，研究范围较局限，分子生物学证据不充分等。因此，今后农杆菌介导单子叶植物的研究还需进一步加强对转化机制的认识，尤其是在分子水平对其深入探讨，确定T-DNA转移过程的信号定位以及外源目的基因的定点插入等分子机理；同时从分子生物学的角度对农杆菌介导遗传转化步骤中，影响转化率的相关因素的主要作用进行更科学完善的分析；其次，对外源基因在转基因植株后代中的遗传情况进行鉴定，在遗传学方面给予更充分的科学凭证。

近年来，一些与农杆菌介导法相结合的转化方法相继产生、发展，并取得了一定效果。如花序浸泡法等，不仅简化了农杆菌侵染的复杂步骤，而且也在一定程度上提高了转化效率，但这些方法应用还不十分广泛，需要进一步的完善与发展。在单子叶植物研究范围方面还缺乏广泛性，受体植物品种较少，种类局限，大部分研究都是围绕在禾本科农作物，在今后的研究中，可以扩大研究对象范围，增加并丰富农杆菌介导单子叶植物的科学依据。

长期以来，农杆菌介导的单子叶植物的遗传转化都基于实验室理论研究，实践应用还不广泛，利用有价值的单子叶植物进行遗传转化，获得目的基因的表达产物以应用于工业生产或是畜牧业发展都具有重要的经济商业价值。相信随着转基因技术的快速发展，通过农杆菌介导获得的单子叶植物转基因新种质将会越来越多，转基因产品资源将会日益丰富。

［1］ Portrykus I. Gene transfer to plants：assessment and perspectives［J］. Physiol Plant, 1990, 79：125-134.

［2］ Hernalsteens JP, Thia-Toong L, Schell J. An Agrobacterium-transformated cell culture from the monocot Asparagus officinalis［J］. The EMBO J, 1984, 3：3039-3041.

［3］ 王晓丹, 刘录祥, 赵林姝.农杆菌转化小麦的研究进展［J］.麦类作物学报, 2007, 27（4）：735-739.

［4］ Cheng M, Fry JE, Pang S, et al. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens［J］. Plant Physiol, 1997, 115（3）：971-980.

［5］ 郭丽, 谷俊涛, 龙素霞, 等.根癌农杆菌介导小麦成熟胚的遗传转化研究［J］.华北农学报, 2009, 24（增刊）：54-57.

［6］ 刘香利, 陈明利, 赵惠贤, 等.小麦农杆菌转化体系的优化及 HMW-GS1Bx14 基因转化［J］.中国农业大学学报, 2011, 16（6）：25-31.

［7］ 石珍源, 殷桂香, 杜丽璞, 等.小麦大龄幼胚再生性能改进与农杆菌转化［J］.中国农业科学, 2011, 44（2）：225-232.

［8］ 张月婷, 廖玉才, 黄涛, 等.农杆菌介导的小麦转化体系的优化［J］.华中农业大学学报, 2012, 31（1）：23-27.

［9］ Ishida Y, Saito H, Ohta S, et al. High efficiency transformation of maize （Zea mays L.） mediated by Agrobacterium tumefaciens［J］.Nat Biotechnol, 1996, 14（6） ：745-750.

［10］ 孙传波, 李海华, 郭嘉, 等. 农杆菌介导法向玉米茎尖导入抗草甘膦 EPSPS 基因的研究［J］.生物技术通报, 2011（3）：91-93.

［11］ 刘建波, 吴颖, 刘宏魁, 等.农杆菌介导 AGPL 基因转化玉米的研究［J］.分子植物育种, 2011, 9（1）：57-62.

［12］ 李晓丽, 王建军, 崔瑞洁, 等.大豆铁蛋白 GmFerritin 在玉米中的遗传转化［J］.安徽农业大学学报, 2012, 39（2）：263-268.

［13］ 葛敏, 张体付, 王华, 等.农杆菌介导Cry1 Ab/Ac抗虫转基因玉米植株的获得［J］.江苏农业学报, 2012, 28（2）：254-258.

［14］ Baba A, Hasezawa S, Syono K. Cultivation of rice protoplasts and their transformation mediated by Agrobacterium spheroplasts［J］. Plant Cell Physiol, 1986, 27（3）：463-471.

［15］ Hiei Y, Ohta S, Komari T, et al. Efficient transformation of rice （Oryza sativa L.） mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA［J］. Plant J, 1994, 6：271-282.

［16］ 吴振映, 柳絮, 王文英, 等.利用农杆菌介导法获得转 cry2A*抗虫基因水稻的研究［J］.山东农业科学, 2011（5）：1-3.

［17］ 王春萍, 谢树章, 蒋晓英, 等.农杆菌介导的籼稻科恢 675 快速遗传转化体系的建立［J］.西南农业学报, 2012, 25（1）：1-5.

［18］ 周融希, 吴颖, 邹宏达, 等.农杆菌介导法将大麦胚乳特异型启动子启动的小麦GBSSⅠ基因转化玉米自交系［J］.分子植物育种, 2012, 10（1）：30-34.

［19］ 张佳星, 何聪芬, 叶兴国, 等.农杆菌介导的单子叶植物转基因研究进展［J］.生物技术通报, 2007（2）：23-26.

［20］ 易自力, 曹守云, 王力, 等.提高农杆菌转化水稻频率的研究［J］.遗传学报, 2001, 28（4）：352-358.

［21］ 叶兴国, 王艳丽, 康乐, 等.农杆菌敏感小麦基因型的筛选及其转化［J］.作物学报, 2005, 31（12）：1552-1556.

［22］ 王宏伟, 梁业红, 史振声, 等.农杆菌介导玉米愈伤遗传转化研究［J］.种子, 2011, 30（1）：1-4.

［23］ 李欣, 刘凌云, 杜丽璞, 等.十二个小麦新品种成熟胚再生性能与农杆菌侵染敏感性评价［J］.中国农业科技导报, 2012, 14（2）：40-46.

［24］ 许东晖, 李宝健, 刘煜, 等. 对根癌农杆菌 vir 区基因具诱导作用的水稻信号分子的分离和确定［J］.中国科学C辑, 1996, 26（6）：535-541.

［25］ 王永勤, 肖兴国, 张爱民, 等.农杆菌介导的小麦遗传转化几个影响因素的研究［J］.遗传学报, 2002, 29（3）：510-515.

［26］ 马建华, 郑寒, 彭姚, 等.农杆菌介导的“川农”系列小麦品种遗传转化效率研究初探［J］.种子, 2011, 30（3）：40-43.

［27］ 叶兴国, 王新敏, 王轲, 等.提高植物农杆菌转化效率辅助策略研究进展［J］.中国农业科学, 2012, 45（15）：3007-3019.

［28］ Yang AF, He CM, Zhang KW, et al. Improvement of Agrobacteriummediated transformation of embryogenic calluses from maize elite inbred lines［J］. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant, 2006, 42：215-219.

［29］ 王志成, 易自力, 蒋建雄, 等.农杆菌介导转化水稻方法的改进［J］.长沙理工大学学报：自然科学版, 2008, 5（3）：98-103.

［30］ Chhabra G, Chaudhary D, Sainger M, et al. Genetic transformation of Indian isolate of Lemna minor mediated by Agrobacterium tumefaciens and recovery of transgenic plants［J］. Physiology and Molecular Biology of Plants, 2011, 17（2）：129-136.

［31］ 陈立国, 后猛, 王玉海, 等.农杆菌介导小麦成熟胚愈伤组织的遗传转化研究［J］.麦类作物学报, 2007, 27（2）：188-192.

［32］ 王旭明, 何道一, 陈丽萍, 等.超声波辅助农杆菌介导的小麦遗传转化初步研究［J］.激光生物学报, 2012, 21（2）：176-180.

［33］ 于惠敏, 夏光敏, 侯丙凯.提高农杆菌介导小麦遗传转化效率的几个因素［J］.山东大学学报：理学版, 2005, 40（6）：120-124.

［34］ 王秀红, 白建荣, 孙毅, 等.农杆菌介导抗草甘膦基因（EPSPS）的玉米转化及相关因子的影响研究［J］.山西农业科学, 2010, 38（1）：11-14.

［35］ 乔定君, 毛萍, 马欣荣, 等.甘露醇及 AgNO3对根癌农杆菌介导的多年生黑麦草遗传转化的影响［J］.草业学报, 2011, 20（1）：102-110.

［36］ Wu X, Doherty A, Jones HD. Efficient and rapid Agrobacteriummediated genetic transformation of durum wheat （Triticum turgidum L. var. durum） using additional virulence genes［J］.Transgenic Research, 2008, 17（3）：425-436.

［37］ Wu H, Doherty A, Jones HD. Agrobacterium-mediated transformation of bread and durum wheat using freshly isolated immature embryos［J］. Methods Mol Biol, 2009, 478（2）：93-103.

［38］ 李明浩, 陈炜, 邢莉萍, 等.农杆菌介导小麦遗传转化条件的优化［J］.分子植物育种, 2010, 8（2）：388-392.

［39］ 徐书举, 杨晓钦, 张仁和, 等. 不同玉米自交系中导入 SAMS基因的转化与检测［J］.西北农业学报, 2012, 21（3）：59-62.