长距离实时定量PCR技术及其在DNA损伤研究中的应用

梁姣 王淑红 张子平 王艺磊

（1.集美大学水产学院，厦门 361021；2.西东大学生物系，新泽西州 07079）

DNA作为生物机体中重要的遗传物质，其本身携带着生命体所有的遗传信息，DNA的完整性关系到生物体的生长、发育、遗传、代谢和繁殖等多种重要的生物学过程。然而，生物机体在自身复制、转录过程中以及暴露于各种外界环境下，极易受到体内或外界因素的影响而产生DNA损伤，正常情况下，大部分的损伤能够被细胞识别并予以修复，但当DNA损伤比较严重或机体DNA损伤修复能力缺失，机体无法正常修复时，带有这种损伤的DNA就会进入半保留复制过程，很容易发生碱基错配，从而引起细胞凋亡，甚至促使机体形成肿瘤，以及形成各种治疗癌症细胞的阻力［1-4］。

造成生物机体DNA损伤的因素有很多。生物体氧化-还原反应代谢过程中产生的自由基，DNA自身在复制重组过程中发生的错配，碱基替换，另外在电离辐射和紫外线照射情况下也会产生氧自由基，环境中化学物质亦能造成一定程度的DNA损伤。常见的DNA损伤会引起肿瘤、癌症［5，6］、糖尿病、心血管疾病及神经退行性疾病等［7-10］。因此，DNA损伤作为外来化合物对机体毒性作用的一个指标，在分子毒理上的应用越来越广泛。同时，DNA损伤也被用于环境化学物的遗传毒性、生物个体环境暴露水平和肿瘤罹患危险度的评价。

1 DNA损伤的类型

外来化合物引起的DNA损伤有多种不同的类型，归结起来，可分为4种主要的类型：（1）碱基损伤，包括形成嘧啶二聚体、碱基共价化合物、碱基烷基化和碱基缺失、转换、颠换；（2）糖基破坏；（3）DNA链交联，包括DNA链内交联、链间交联和DNA蛋白质交联；（4）链断裂［11］，其中链断裂中的单链断裂（single strand break，SSB）是由于间接的DNA损伤所引起的。同时，单链断裂也是由于DNA核糖损伤程度增加直接引起，以及受到内源性活性氧或过氧化氢、电离辐射攻击而产生［12］，更严重的会引起双链断裂（double strand break，DSB）［13］。

2 DNA损伤检测的方法及优缺点

近年来，研究者陆续建立了很多DNA损伤的检测方法，如线粒体基因拷贝数［14］，限制性酶切片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）［15］及温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）［16］等。另外，还包括单细胞凝胶电泳试验（彗星试验，comet assay）［17］、碱解旋（alkaline unwinding）［18］和微核测定法（micronuclei test）［19］等。虽然这些方法各有特点，但DNA损伤研究对象都集中在基因组，不能对特定基因的损伤进行直观或精确的定位定量检测与分析。此外，这些方法对DNA损伤的程度也不能做到精确的定量。目前，虽有一些可用于特定基因检测的方法，如单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）［20］和8-氧基鸟嘌呤（8-oxoG）［21］的分析测定，但这些方法主要用于碱基突变或特定碱基损伤的检测，而不能检测基因的总体损伤情况。同时，这些方法都需要大量的DNA及引物，而8-oxoG虽然不需要引物，但经常需要和其他技术，如高效液相色谱-电化学法、酶联免疫吸附法等结合使用［22］，工作量大且耗时较长。

3 PCR技术在DNA损伤研究中的应用

日本Higuchi等［23］于1992年首次采用动态PCR方法和封闭式检测方法对目的核酸数量进行定量分析，提出荧光定量PCR技术的概念。1995年，美国Applied Biosystems公司成功研制了TaqMan技术，1996年又推出了首台荧光定量PCR检测系统。该系统通过在PCR反应体系中加入荧光染料，使之与双链DNA结合从而收集荧光信号，利用收集的荧光信号再对整个PCR进程进行实时监测，并使用Ct值进行分析，通过做标准曲线对未知模板进行定量分析［24，25］。相较于常规PCR方法无法对起始模板准确定量且只能对终产物进行分析的局限性，实时定量PCR方法是目前确定样品中DNA（cDNA）拷贝数最敏感、最准确的方法，具有自动化程度高、重现性好和无污染等特点，目前已经在分子生物学领域和医学领域得到广泛的使用。

常规Real-time QPCR技术应用于DNA损伤的研究虽早已有报道，但其通常需要与其他技术结合使用，并且操作步骤繁琐，同时也增加了试验过程中误差形成的可能性。Neher等［26］通过单个线虫暴露于苯并芘和荧蔥中，用提取的DNA先采用PCR技术扩增出ced-1基因16 144 bp和rpa-1 281 bp长度的片段，进而通过Real-time QPCR技术从扩增的ced-1基因中选择109 bp的片段作为扩增的目的片段，rpa-1中选择81 bp的片段作为扩增的参比片段，经苯并芘和荧蔥处理下的DNA会形成加合物，而加合物的存在会抑制DNA的扩增。将处理组目的片段和参比片段的比值与未处理组目的片段和参比片段的比值相比，当比值≤0.05时，表明有抑制了PCR反应的DNA加合物的存在。通过Real-time QPCR结合8-oxoG技术，孙玉等［27］采用亚甲蓝联合可见光（MBL）方法处理肝癌细胞株（HepG2），使得DNA链中鸟嘌呤被氧化成8-oxoG，而8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶（8-oxoguanine DNA glycosydase）可特异切割8-oxoG位点，与未经处理的DNA相比，经酶切后完整的DNA模板减少，再经Real-time QPCR法扩增时，表现为Ct值较大的现象，从而可以反推DNA中8-oxoG的含量，进而成功构建了DNA的氧化损伤模型。

Rothfuss等［28］利用Real-time QPCR分析神经母瘤细胞系SH-SY5Y经H2O2暴露后线粒体基因组不同位置DNA损伤情况，试验过程中，选取线粒体ND5、ND1/ND2、COⅡ/ATPase6/8及D-Loop 4个位置，扩增其大小在1 kb左右的片段，根据mtDNA区域每10 kb DNA所包含对应长片段的长度计算出DNA的损伤，得出线粒体DNA损伤率与扩增片段的长度成反比的结论，并验证了线粒体不同区域对损伤的敏感程度不同的说法。

Santons等［29］在研究哺乳动物细胞核DNA，线粒体DNA损伤及修复的过程中建立了一种长距离PCR的方法，该种方法检测DNA损伤的原理是基于多种类型的DNA损伤都可以减缓或阻止DNA聚合酶的进程。其优点在于能直接从总DNA中直接检测线粒体DNA的完整性而不用再单独分离出线粒体DNA，并且能够准确的检测核DNA和线粒体DNA的损伤程度。之后，很多学者将该技术应用于人类疾病和模式生物DNA损伤的检测。Jung等［30］用长距离定量PCR（LA-QPCR）方法检测大西洋鳉鱼线粒体DNA和核DNA损伤的情况，通过向相对未受污染的鱼体内注射苯并芘，测定肝、脑、肌肉组织中DNA的损伤程度。同时，还检测了受污染区域的大西洋鳉鱼肝、肌肉DNA的损伤，认为长距离定量PCR技术为评估DNA损伤提供了灵敏的检测手段。在研究人类疾病方面，长距离定量PCR技术也发挥了重要作用。用此方法，Van等［31］验证了正常人类的成纤维细胞中转录的次黄嘌呤转移酶基因比非转录的beta-球蛋白基因修复率更高的说法。而Fukagawa等［32］也采用长距离定量PCR的方法验证了衰老和基因肥胖型会造成体内线粒体DNA缺失。此外，长距离定量PCR技术还可用于检测人肺癌细胞系PLK3/PRK基因内含子及外显子的结构和多态性分析［33］。

尽管LA-QPCR技术在DNA损伤检测方面得到很多的应用，但该方法采用的是终点检测法，对模板浓度和PCR循环数都有较高的要求，不能对PCR情况进行实时监测。近年来，一些学者考虑将实时定量PCR技术和长距离定量PCR技术结合。Vidal等［34］于2005年最早报道了LA-real time QPCR技术在检测A型血友病凝血因子VIII基因22号内含子倒置试验中的应用。该研究分别扩增了阳性个体，阴性个体及女性A型血友病携带者3个试验组内含子区域12 kb及11 kb长度的片段，并根据Ct值的大小可以一步快速检测A型血友病VIII基因突变的情况。Maruyama等［35］应用LA-real time QPCR技术扩增了4.1 kb、8.5 kb和15.5 kb的质粒片段，可以灵敏的检测河流中胞外质粒的存在。Edwards［22］采用LA-real time QPCR技术成功扩增了15 kb 几乎可以覆盖整个线粒体基因组的长片段，可以快速，高重复性的检测线粒体的DNA损伤。

4 长距离实时定量PCR技术

常规的Real-time QPCR，为了保证扩增效率，扩增目的片段的长度要求在50-300 bp之间，一般不会超过400 bp［36］。LA-QPCR能够扩增的目的片段可达20 kb左右［37，38］，这就对PCR反应条件提出了很多的挑战。经过多次探索并参考前人的研究结果，结合Real-time QPCR技术和LA-PCR技术，我们建立了一整套LA-real time QPCR的相关技术，现详细介绍如下。

4.1 DNA模板

LA-real time QPCR扩增DNA的片段长度可以达到20 kb，这就要求所提取的DNA具有高度的完整性，生物体基因组DNA的链一般比较长，在提取DNA的过程中，由于用力过猛或试验操作不当，很容易造成DNA链的断裂。我们知道，在PCR扩增的过程中，引物分正向、反向同时从3'和5'端向中间扩增，如果DNA链发生断裂，PCR扩增就会中断，近而影响PCR的扩增效率。因此，在裂解组织块的过程中，我们使用研磨棒研磨组织块，加入细胞裂解液后水浴裂解细胞，而非使用均浆机对组织快速研磨，同时提取DNA时，动作要轻缓，加入试剂后尽量避免反复吹打。在整个LA-real time QPCR的过程中，模板质量很重要，因为模板长度较长，在利用琼脂糖凝胶电泳检测模板质量时，胶的浓度要控制在0.6%左右。目前市售的适合长片段DNA检测的marker已有多种，例如，TaKaRa、天根生化科技公司等生产的λ-Hind Ⅲ digest DNA marker。

4.2 DNA聚合酶

TaKaRa公司研制的LA-Taq是应用LA-PCR原理研制的具有3'→5'核酸外切酶的活性（具有校对，Proof reading的活性）的耐热性DNA聚合酶。无论是扩增短链DNA还是长链DNA，其效率都优于其他同类产品，尤其在扩增大于10 kb的DNA片段方面，其优势更加明显，而且保真性很强。在PCR进程中高温加热前抗Taq单克隆抗体与LA-Taq酶结合，抑制聚合酶的活性，从而抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，能更有效地减少PCR过程中的非特异性反应，增强PCR扩增的特异性，得到良好的PCR结果［39］。

4.3 荧光染料

在荧光定量PCR反应体系中，需要加入荧光报告基团以确定反应过程中扩增产物的量的变化。而常用的荧光染料包括SYBR Green Ⅰ，这是一种非饱和菁类荧光素，能够特异的识别双链DNA并结合在DNA双链上［40］，是应用最广泛的化学检测物质，但这种结合也是非特异的，它能够与任何的dsDNA（如引物二聚体等）结合，造成试验的假阳性结果。另外，还会出现的另一个问题是它会抑制PCR的进程，优先结合G+C含量丰富的片段［41］，当扩增的片段较短时，SYBR Green Ⅰ对PCR反应的抑制作用影响不大，但当扩增片段的长度大于10 kb左右的情况下，SYBR Green Ⅰ的抑制作用将使PCR不能正常扩增。我们在试验中采用了不同浓度的SYBR GreenⅠ都未能成功扩增出长度为14 092 bp的斑马鱼线粒体片段。

在本实验室建立的LA-real time QPCR技术中所采用的荧光染料为SYTO-82。Gudnason等［41］的研究表明，SYTO-82不抑制PCR的进程，不会优先结合G+C含量丰富的片段，而且较高的工作浓度也不会影响解链温度和Tm值。因此，在LA-real time QPCR 时使用SYTO-82作为荧光染料，得到了较好的扩增效率（E=1.696），且不同模板浓度下R2=0.994，说明扩增效率重现性很好，即使用SYTO-82作为荧光染料扩增片段长度为14 092 bp的片段仍可以得到良好的扩增效率。同时为了平衡PCR加样误差所引起的PCR管与管之间的差异，在PCR反应体系中加入ROX参考染料［42］。

4.4 引物

引物的选择是PCR能否成功扩增的关键，一般来说，长片段引物的碱基数要比普通PCR反应所需的引物要长，一般为24±2个核苷酸，这样能够增加其与模板结合的稳定性；而且G+C含量也要控制在50%左右。决定PCR反应的另一个重要因素是引物的Tm值，因为扩增的片段比普通PCR反应较长，这就需要Tm值也比普通的较高，其范围应该在68℃左右。与普通PCR的引物设计一样，在设计长片段引物的过程中，也要考虑错配和引物二聚体的问题，从而使引物的设计符合长片段PCR反应的要求［29］。

4.5 数据分析

在使用常规实时定量PCR技术研究基因表达的过程中，样本间的误差会干扰试验数据，为了得到更精确的数据，通常需要一个或多个内参基因来消除起始样本的误差及反应效率的误差。一般常选择看家基因（housekeeping gene）作为内参［28、43，44］，LA-real time QPCR也需要相应的内参对DNA中某片段的初始浓度进行标准化，以消除样品提取过程中产生的影响。首先选取长度约20 kb的DNA片段，设计引物，扩增出较长的片段，在扩增的长片段中选取200 bp左右长度的片段，设计引物扩增该片段，因选取的短片段与长片段在同一个序列中，相对于长片段，短片段受损伤的几率很低，其拷贝数可以用来校准长片段的拷贝数。

常规的Real-time QPCR技术一般采用2-ΔΔCt的方法计算目的基因的相对表达量，该方法是建立在参比基因和目的基因的扩增效率都接近100%的基础上的。但是，当扩增的片段较长时，无论怎么优化条件，其扩增效率不可能达到100%。Rothfuss等［28］根据Real-time QPCR建立起来的半长距离实时定量PCR（Semi-long real time PCR）技术虽然扩增的长度在1 kb左右，但1 kb的片段扩增效率在69.4%-89%之间，在分析数据时他们仍采用了2-ΔΔCt的计算方式，致使结果有很大的误差。而本试验在扩增斑马鱼线粒体长度为14 092 bp的片段时，计算得出的扩增效率为69.6%。因此，我们在数据分析时，采用ET

CtT（C）-CtT（S）/ERCtR（C）-CtR（S）的公式［45］，公式中ET、ER分别指长距离片段和短距离片段的扩增效率，CtT（C）-CtT（S）、 CtR（C）-CtR（S）分别指长距离片段和短距离片段介导的处理组和对照组DNA模板定量扩增得到的Ct值，数据分析考虑了不同片段的扩增效率，使结果更加准确。

5 结语

随着人们对DNA损伤及其修复机制研究的不断深入，对于DNA损伤检测技术的要求也越来越高。LA-real time QPCR技术由于所需DNA量少，检测灵敏度高等优点，尽管在区分不同类型和具体损伤位点方面有所欠缺，但就现有的试验技术而言，LAreal time QPCR无疑为DNA损伤的检测提供了更为方便快捷的技术手段。随着技术的不断进步，或与其他检测方法的联合应用，相信LA-real time QPCR在检测环境污染物对生物体DNA损伤以及人类一些相关疾病的诊断方面将会得到越来越多的应用。

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