葱蒜类蔬菜遗传转化研究进展

高行英 李梅兰 王婷婷 侯雷平

（山西农业大学园艺学院，太谷 030801）

葱蒜类蔬菜是百合科葱属中以嫩叶、假茎、鳞茎或花薹为食用器官的二年生草本植物。该类蔬菜在我国栽培历史悠久，在不同的生态环境下通过人工选择和自然淘汰，产生了丰富的形态变异和生态分化类型，包括洋葱（A. cepa L.）、大蒜（A. sativum L.）、韭菜（A. tuberosum Rottl. ex Spr.）、大葱（A. fistulosum L.）、细香葱（A. schoenoprasum L.）、韭葱（A. porrum L.）、胡葱（A. ascalonicum L.）和薤（A. chinensis G. Don） 等［1］。

葱蒜类蔬菜以其丰富的营养成分以及独特的辛香风味而成为调味佳品，同时又有药用和保健价值。如韭菜中含丰富的维生素C、碳水化合物及硫、磷和铁等矿物质，尤其富含胡萝卜素和纤维素，还含有辛香的挥发性物质——硫化丙烯，有增进食欲和杀菌的作用［2］；洋葱含有蛋白质、粗纤维及糖等多种营养成分，还含有18 种氨基酸及硒、锌、铜及镁等多种微量元素，除具有杀菌作用外，还具有抗心血管疾病、抗癌、降血压及防治骨质疏松等作用［3］；而大蒜对葡萄球菌、肺炎双球菌及大肠杆菌等均具有杀灭作用，且具有降血压、降血脂、抗衰老、抗血栓形成和防治糖尿病等功能。此外，还有抗氧化、抗癌、抗突变、抗气喘和免疫调节等很多生物学活性［4］。近年来，研究还发现这类植物中含有一类含硫化合物——蒜素以及与之相关的一些含硫次生代谢物，在防治肿瘤方面也有独特的作用，使其作用及其机理的研究倍受关注［5］。

随着转基因技术的日益成熟，许多植物已经取得新品种，这也为葱蒜类蔬菜的育种提供了一条新的途径。目前，在葱蒜类蔬菜的转化研究方面已经取得了一些成果。本文是通过对葱蒜类蔬菜遗传转化的研究进行总结，以期为葱蒜类的遗传转化提供参考。

1 转化成功的蔬菜种类和性状

有关葱蒜类蔬菜遗传转化的研究从20世纪90年代就已开始一以来对于相关的各种因素进行了优化，最早研究成功的是洋葱。Eady和Joubert等［6，7］对洋葱转化过程中的相关因素包括酚类物质的作用进行的研究和探讨，成功进行了遗传转化，其将GUS基因导入洋葱并进行了表达［8］。之后Barandiaran等［9］将GUS基因导入大蒜中，核酸分析的结果表明该基因已经整合到大蒜的基因组中；Zheng等［10］将目的基因导入韭葱体内后，组织的GUS染色效果明显，转基因植株移植到温室后生长良好；张松等［11］采用农杆菌介导法对韭菜进行遗传转化，通过PCR分析及Southern检测，外源基因已经整合到韭菜染色体上；谭伟等［12］对大葱转化中的各种因素进行优化，并成功获得转基因大蒜新品种。葱蒜类蔬菜遗传转化陆续成功，目前已经获得成功的品种包括：大蒜、韭葱、大葱及韭菜等，其中研究最多且最成熟的为洋葱和大蒜。

从转化的性状看，最早获得的是抗除草剂基因的导入。Eady等［13］利用农杆菌介导法将Bar基因导入洋葱幼胚得到抗除草剂植株，用草铵膦喷雾处理，转基因植株仍能正常生长；Sun等［14］将Bar基因导入洋葱表皮细胞得到抗除草剂洋葱品种；Park等［15］以大蒜愈伤组织作为受体，利用基因枪转化抗除草剂基因，获得再生植株，当除草剂浓度为3 mg/L时，植株仍能生存。另外，抗虫基因的导入也相当成熟。Zheng等［16］将cry1Ca基因转入大蒜愈伤组织得到转基因抗虫植株，用转基因大蒜叶片饲喂3 d的甜菜夜蛾幼虫，结果表明转cry1Ca基因的大蒜对甜菜夜蛾具有抗性；谭伟等［12］将苏云金杆菌基因CryIA （b）转入大葱组织得到抗虫大葱。

另外，还进行了抗逆性方面的转化。徐启江等［17］将锌指蛋白OSISAPI基因导入洋葱鳞茎盘胚性愈伤组织转化后，进行NaCl和NaHCO3复合盐进行胁迫处理，当总浓度为200 mmol/L时，处理7 d后未转基因植株枯萎黄化、甚至死亡，而转基因植株生长正常，且转基因植株的最大耐受浓度为400 mmol/L；刘海燕等［18］将MpASR基因导入洋葱表皮在非生物胁迫，如冷、干旱、盐、水淹、重金属和机械伤害等条件下诱导表达，从而获得抗逆境能力很强的洋葱植株。洋葱中含有致泪成分环蒜氨酸，Kamata等［19］将催泪因子合成酶（LFS）基因导入洋葱体内，得到抑制环蒜氨酸合成的洋葱品种。

2 遗传转化的方法

目前，已成功实现葱蒜类遗传转化并获得转化植株的方法，即基因枪法和农杆菌介导法。1987年，Vlein首先报道了利用基因枪法将TMV（烟草花叶病毒）RNA吸附到钨粒表面，轰击洋葱表皮细胞，经检测发现病毒RNA能进行复制，并以同样技术将CAT基因导入洋葱表皮细胞；Eady等［8］通过基因枪法转化洋葱胚根尖，培养1-2周的根尖GUS表达率达到20%左右，4-8周根尖的表达率达到30%；徐启江等［17］转化洋葱胚性愈伤后的GUS基因瞬时表达率达到73.33%；Sun等［14］对洋葱鳞茎表皮细胞进行转化，转化规模为90%，转化的细胞率为2.5%；Aswath等［20］成功应用该法转化了洋葱愈伤组织，转化率达到23%；Barandiaran等［9］应用基因枪法介导转化了不同大蒜外植体包括成熟种子、未成熟种子、嫩叶及愈伤组织，PCR结果表明所有的材料均能进行转化，而GUS瞬时表达率表明叶片的转化效果最佳，幼嫩鳞茎次之，表达率均达到40%以上。

农杆菌介导法是目前应用最广泛，且结果较为理想、技术较为成熟的一种基因转化方法。Eady等［8］以农杆菌介导洋葱转化，GUS染色瞬时表达为15%左右；Aswath等［20］转化了洋葱愈伤组织，转化率为27%；而Sun等［14］以农杆菌介导洋葱转化后，转化规模为30%，转化的细胞率为11%，说明两种转化方法分别有各自的优点。另外，Kamata等［19］转化洋葱愈伤组织后GFP的荧光表达率达到50%；Kondo等［21］转化大蒜茎尖分生组织后，Southern杂交检测表明转基因株系都是单拷贝；Eady等［22］采用农杆菌介导法转化韭葱和大蒜也得到两个转基因株系。

3 采用的外植体种类

葱蒜类蔬菜可作为外植体的组织包括茎尖、鳞茎盘、双鳞片、花蕾、子房、胚珠、花托和未成熟的胚等。目前，遗传转化中所用的受体材料多为愈伤组织，其来源众多，最常用的是种子胚根。Zheng等［10］用大蒜幼胚和成熟种子作为外植体诱导愈伤组织进行转化获得了转化植株；Aswath等［20］用洋葱成熟胚，通过愈伤组织再生途径成功获得转基因再生植株，且转化率达到20%以上。另外，Zheng等［16］以试管苗根尖、珠芽诱导的愈伤组织进行转化及再生也获得了转化体，胚根尖的转化率达到1.47%，试管苗根尖的转化率为1.23%，而株芽的转化率仅有0.32%；Buiteveld等［23］用韭葱的胚性愈伤组织建立的胚性悬浮细胞系分离原生质体，经培养获得了再生植株，从而为转化奠定基础。

在葱蒜类蔬菜的转化过程中，常采用幼胚、根尖、叶片和茎尖等组织直接进行转化。Sun等［14］、刘海燕等［18］和刘肖等［24］以洋葱表皮直接进行转化获得成功，而Eady等［25］多用洋葱幼胚直接进行转化，转化后的细胞进入再生体系得到转基因植株。Barandiaran等［9］用洋葱幼嫩叶片进行转化，GUS瞬时表达达到40%以上；Kenel等［26］对大蒜幼嫩叶组织进行转化，其GFP表达率达到55%，转化效率为4.1%。另外，Eady等［8］还以预培养2 d的胚根进行转化，GUS表达率达到20%；张松等［11］用预培养6 d后的根尖转化后再生率达到39%，出芽率达到4%。

4 农杆菌介导转化的相关因素

在农杆菌介导的遗传转化中，存在多种遗传因子和外界因素影响。为了提高转化效率，人们从植株基因型、菌株及菌液浓度、侵染条件和共培养条件等方面对农杆菌介导遗传转化方法进行优化，不同程度地提高了转化效率［27］。

4.1 植株基因型

不同基因型对农杆菌的敏感程度不同，Zheng等［16］研究表明3种大蒜品种Messidrome、Morasol发现Printanor转化后，Printanor的转化率为1.5%左右，而其他品种的转化率仅在0.5%左右；Zheng等［10］研究Atlas、Bawang Bali和Kuning 3种大葱品种及Sturon和Hyton洋葱品种对转化的影响发现，Bawang Bali的GUS瞬时表达达到70%，而Atlas为40%左右。另外，植物基因型还通过影响再生体系的建立而影响转化，Bohanec等［28］取洋葱子房诱导单倍体，4个品种中Daytona再生频率为0，而Xph3371再生频率为7.6%；张松等［29］同样取韭菜14个品种根尖，其愈伤组织诱导率和不定芽诱导率也不同。Saika等［30］在不同水稻品种Nipponbare和Kasalath对转化影响的结果表明，Kasalath的绿色荧光性和转化效果更高，也说明了这一问题。

4.2 农杆菌菌株和菌液浓度

农杆菌菌株属性对转化的成功具有决定性影响。不同菌株对同一受体材料的侵染能力相差较大。许多报告表明，EHA101、LBA 4404、A281、C58和ASE1等菌株的转化效果较好。葱蒜类植株转化中最常用的菌株为LBA4404。Zheng等［10］用两种菌株EHA105和LBA4404进行转化，对香葱而言LBA4404的效果好，而对洋葱而言EHA105的效果更好；杨爱国等［31］在农杆菌介导玉米转化中的研究表明，EHA105菌株转化后GUS表达率达到70%，再生率达到20%，而用LBA4404进行转化GUS表达率为40%，再生率为14%。

菌液浓度对不同的植物外植体转化存在差异。浓度过低时，农杆菌数量过少，导致转化效率较低；随着浓度的升高，转化率有所上升；但浓度过高时，农杆菌将外植体全面包围，不利于洗菌，导致部分外植体死亡，使转化率下降。在葱蒜类蔬菜的遗传转化中大多采用的菌液OD600为0.6左右，刘海燕等［18］研究表明，OD600为0.6时，洋葱表皮细胞的转化率均值最大。当OD600为0.2时，转化效果不明显，转化率随农杆菌浓度的增加而增加；而当OD600大于0.6时，洋葱表皮细胞呈空泡化，死亡细胞越来越多。Kamata等［19］则认为洋葱悬浮培养的愈伤组织转化所用浓度OD600为0.1-0.2。Kondo等［21］在大葱转化中，农杆菌的OD600值也为0.6；Eady等［22］在韭菜和大蒜转化时，OD500下的菌液浓度为0.5-1.0时效果最佳，本研究结果也表明，韭菜转化中最佳的菌液浓度OD600为0.6。

4.3 侵染方式和时间

单子叶植物细胞缺乏农杆菌附着位点，农杆菌侵染方式一般是应用创伤细胞：菌液浸泡侵染；抽气减压和超声波辅助的农杆菌介导法（SAAT ）等促进农杆菌的吸附，提高转化效率。Eady等［25］认为先将洋葱幼胚与菌液涡旋混合30 s，然后将组织放置在真空环境中渗透30 min，菌液侵入组织的效果最佳，而且此方法被很多研究人员采纳，用于韭菜和大蒜等植株的转化。张松等［11］用直接浸泡法侵染表明，当菌液OD600为0.6时，侵染5 min，韭菜转化率达到5. 6 %。

菌液侵染时间对转化也是相当重要的，侵染时间短时，菌体与受体细胞接触时间短，吸附于外植体的菌体少，转化率低；随着侵染时间的延长，转化率得到提升，但侵染时间过长，菌体数目过大会导致受体细胞受到严重的损伤，且不能彻底除菌。葱蒜类蔬菜的侵染时间不等，常用的侵染时间为5-10 min。Aswath等［20］转化洋葱时的侵染浓度为5 min；Zheng等［10］侵染大蒜的时间为10 min；刘肖飞等［24］则认为将洋葱表皮侵染20 min的转化效率最高；徐春波等［32］在紫花苜蓿的遗传转化中，菌液OD600为0.6，侵染10 min时，GUS阳性发生率最高，与本研究通过农杆菌介导韭菜转化的试验结果一致。

4.4 共培养条件

共培养在整个转化过程中完成农杆菌的附着、T-DNA的转移整合，农杆菌附着外植体表面后并不能立刻转化，只有在创伤部位生存一定时间后菌株才能诱导肿瘤。谭伟等［12］在大葱的研究中表明，GUS 基因瞬间表达率均值从大到小依次是共培养时间3 d> 2 d> 4 d> 1 d> 5 d；共培养时间<3 d时，随共培养时间的延长，GUS 基因瞬间表达率增加；>3 d时，则相反。Eady等［13］认为菌液用真空渗透法处理30 min，再进行共培养6 d后的转化效率最高。共培养温度在转化中充当着重要的角色。虽然，外植体共培养试验通常采用25℃，但是认为较低的温度（19-22℃）是更佳。Kondo等［21］在大葱的研究中，当温度为22℃时GUS瞬时表达率最高，为64%，温度为20℃时GUS表达率54.2%，而温度为24℃时反而下降到44.2%。我们在韭菜转化中研究结果表明，共培养3 d为最佳时间。

4.5 Vir 基因的活化

1985年，Stachel等［33］首次从烟草叶片的伤口中分离出乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（HOAS），并证明这些酚类物质能激活Ti 质粒上Vir 区基因的表达。Joubert等［7］研究了酚类物质对洋葱转化遗传的影响发现，当AS浓度为100 μmol/L时，细菌的生长和Vir毒性的活化能力最高；对洋葱幼胚进行转化，AS浓度为250 μmol/L，组织的GUS表达率为60%，浓度过高时表达率反而下降。另外，在100 μmol/L浓度下，多种酚类化合物的作用中，AS的作用最佳；其次为苄叉丙酮。Eady等［25］在菌液培养过程中加入200 μmol/L AS诱导活化农杆菌4 h后用于转化，转化效率达到2.7%。张佳星等［34］阐述了单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，需添加外源信号物质如AS来促进侵染效果，AS是农杆菌与植物共培养时必不可少的。

5 展望

运用基因工程培育转基因葱蒜类新品种为育种开辟了新的途径，具有广阔的应用前景，但在实际工作中存在许多问题和挑战。首先，可用于葱蒜类转化的基因较少，遗传转化技术需要克服植株再生、基因型的依赖性，以及组织培养中的遗传变异等问题；其次，外源基因在转基因植株体内的表达效果不甚理想，基因沉默是转基因过程普遍存在的问题；再次，转基因安全性问题尚未完全明了和控制。因此，需要挖掘更多的基因资源用于葱蒜类遗传转化，不断完善已有的转化方法，发展新的转化体系和方法，建立起一个转化效率高、重复性好、简易、快速及适应性广的高效转化体系，从而使目的基因由随机整合到定向定位整合，多个目的基因导入同一受体并在转化植株中完整地表达。同时，对标记基因进行去除或改造，或培育无抗生素标记基因（PMI）的转基因植物，建立健全转基因安全评价机制。葱蒜类转基因技术现今尚未完善，优良农艺性状基因的转化较少。因此，对葱蒜类蔬菜进行进一步遗传转化研究非常必要，以得到更加优质的品种。

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