低聚半乳糖检测方法研究进展

张志国

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司研发中心，内蒙古 呼和浩特 011500）

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是由2 个～8 个单糖通过β-糖苷键连接形成直链寡糖，不能被人体上消化道消化吸收，可以直接进入大肠。经过国内外科学家的大量研究，低聚半乳糖具有低能量、促进肠道双歧杆菌的增殖、改善矿物质元素的吸收和防止骨质减少、改善脂质代谢、预防、治疗便秘、低致龋齿性、生成营养物质，改善营养状况、提高免疫力、增强抗肿瘤和抗衰老等营养功能[1-2]。

低聚半乳糖在日本已经广泛的被用作甜味剂、糖的替代品、食品原料、功能性食品原料，在各类食品中添加。我国卫生部已经批准GOS 为新资源食品，并且允许添加在婴幼儿食品、乳制品、饮料、焙烤食品、糖果中（中华人民共和国卫生部公告2008 年第20 号，中华人民共和国卫生部公告2007 年第12 号）[3]。

因为低聚半乳糖是一系列半乳糖基低聚糖的混合物，聚合度从2 到8 不等，有15 种以上的组分[4]，用外标法检测存在一定的困难，所以低聚半乳糖检测技术是低聚糖检测研究的重点。下面从国内外低聚半乳糖检测技术的研究情况、存在的问题和研究方向分别进行介绍。

1 低聚半乳糖检测方法研究现状

低聚半乳糖属于低聚糖，而低聚糖的分离检测技术一直是科研工作者研究的重点。Richard C et al[5]在1986 年采用纸色谱检测了婴儿配方乳中的乳果糖和大豆低聚糖，Takamitsu chaka et al[6]采用薄层色谱法分离了藻朊酸纤维低聚糖，Splechtna B et al[7]采用薄层色谱法分析了转糖基产物中的低聚半乳糖。

对于低聚糖的分离检测技术，高效液相色谱法研究相对多一些[8]，高效液相色谱法主要利用低聚糖的易溶特性，在糖柱、氨基柱、凝胶柱上分离效果较好的特点，一般采用示差折光检测器检测。随着技术的进步，Antonopoulos A et al[9]用蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detection，ELSD）检测低聚糖的研究，蒸发光散射检测器比示差折光检测器检出限高1～2个数量级，具有比较好的前景。Hirotaka Kakita et al[10]把单糖和低聚糖进行荧光素衍生后，利用HPLC 法检测取得了较好的效果。

随着技术的发展，也有用质谱进行低聚糖分离和结构分析的研究。林勤保等[11]用气相色谱-质谱联用法测定了大枣低聚糖的单糖组成，结果发现大枣低聚糖的单糖组成为阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，同时测定了大枣中单糖的组成成分为果糖和葡萄糖，取得了较好的效果。Broberg A[12]用高效液相色谱串联离子阱质谱进行了低聚糖的分析。Ying Liu et al[13]采用液相色谱和液相色谱串联电喷雾电离质谱进行了低聚糖分离和鉴定。

另外，冯咏梅等[14]还采用001×7 阳离子交换树脂柱层析分离提纯低聚半乳糖（GOS）混合物，然后采用薄层色谱分析纯化结果。Kamoda S et al[15]采用激光诱导荧光检测器分析经过毛细管电泳分离的N-连接低聚糖，也取得了良好的效果。还有Dreisewerd K et al[16]采用薄层色谱板分离生牛乳中的低聚糖，然后用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱完成分析，也取得了较好的结果。

下面根据研究较多的分析方法具体介绍一下检测低聚半乳糖的方法，有薄层色谱法（Thin Layer Chromatograpy）、气相色谱法、液相色谱法、离子色谱法。

1.1 薄层色谱法

李玉梅等[17]对低聚半乳糖含量为30%的β-半乳糖苷酶转糖基发酵产物进行了分析。利用薄层色谱法和HPLC 法两种方法。薄层色谱法采用Silica gel 60 制薄层板，展开剂为：正丁醇∶乙醇∶水=5∶3∶2（体积比），薄层显色剂为：20 %硫酸溶液+0.5 % 3，5-二羟基甲苯，糖显色条件为：120 ℃烘烤3 min～5 min，然后用ImageJv1.28 软件进行定量分析。

陆文伟等[18]采用薄层色谱法，并把展开剂调整为：正丁醇∶正丙醇∶乙醇∶水=2∶3∶3∶2（体积比），分析了转糖基产物中的低聚半乳糖含量（含量超过20%）。

许牡丹等[19]采用上行薄层色谱法以硅胶G 做薄层，正丁醇∶水=85∶15 作展开剂，用苯胺-二苯胺-磷酸溶液作为显色剂检测转糖基产物中各个糖组分含量（低聚半乳糖含量大于20%）。

李正义等[20]采用了李玉梅等[17]的相同薄层色谱方法分析了低乳糖牛奶中的低聚半乳糖含量，由于乳糖水解率很高，超过70%，GOS 含量超过20%，所以乳糖的干扰很少。而采用AminexHPX-42C（300mm×7.8mm）糖分析柱，超纯水作流动相，柱温70 ℃的HPLC 条件检测。转移二糖和乳糖的色谱峰重叠，造成低聚半乳糖含量的检测结果偏低，乳糖含量的检测结果偏高。

吴昊等[21]对高效薄层色谱法分析低聚半乳糖及其衍生物进行了系统的研究。试验对薄层厚度、固定相盐效应、硅胶粘合剂浓度、点样的技巧以及展开剂的选择、显色剂优化等进行了优化试验，确定了适合的方法。但是方法适合高低聚半乳糖含量和低的乳糖和半乳糖含量的样品。

1.2 气相色谱法

随着气相色谱法和衍生技术的发展，也有人采用气相色谱分离检测碳水化合物，由于糖的高分子量和沸点高的特点，先把多糖水解成单糖，然后采用衍生试剂把单糖衍生成容易气化的物质，采用气相色谱分离定量，所以气相色谱主要进行单糖组成及含量的分析，操作相对复杂。

刘建福[22-23]把经过分离纯化的低聚半乳糖样品水解、衍生后用气相色谱分析。试验采用OV1701 石英毛细管柱（30 m，I.D.0.32 mm），根据测定的葡萄糖和半乳糖峰面积之比确定分离产物的大致结构，但是没有给出定量方法。

1.3 液相色谱法

采用高效液相色谱检测单糖和低聚糖，是目前较为普遍的方法。前面介绍的研究人员还采用液相色谱法和薄层色谱项结合分析了转糖基产物中的低聚乳糖。比如，李玉梅等[17]还用HPLC 分析了转糖基产物中的低聚半乳糖。将糖浆用0.22 μm 滤膜过滤，以三蒸水作为流动相，柱温80 ℃，色谱柱为Aminex HPX-42A（300 mm×7.8 mm）糖分析柱。陆文伟等[18]也采用HPLC法测定了转糖基产物中的低聚半乳糖含量，流动相用5 mmol/L 硫酸，柱温为50 ℃，色谱柱用Aminex HPX 87H。

Barroso Begona et al[24]采用在线高效液相色谱/飞行时间质谱联用仪分析了糖蛋白来源的低聚糖的结构和类型，分析了N 连接和O 连接的低聚糖，取得了较好的效果。

罗倩等[25]研究了利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）对低聚半乳糖柱前衍生化的方法，并采用硅胶柱层析结合薄层层析，分离检测原料糖浆中低聚半乳糖，采用紫外光检测器在波长245 nm 条件下，可以检测半乳糖、葡萄糖、乳糖、三糖、四糖、五糖。从而进行间接定量。

吴红京等[26]采用反相高效液相色谱仪，以水作为流动相，分离分析了淀粉经过酶水解得到的含2～6 个葡萄糖聚合物的混合物，也取得了比较好的结果。

李静芳等[27]研究了高效液相色谱法测定乳制品及糖浆中低聚半乳糖含量的方法。以水和乙腈为流动相，用氨基柱将葡萄糖、半乳糖和乳糖与其他物质分离，用示差折光检测器检测定量。通过检测计算低聚半乳糖酶解成的半乳糖含量，来计算样品中低聚半乳糖含量。葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖的相对标准偏差分别为2.72%、4.16%、1.16%、4.26%。此法的线性相关系数为0.999 0～0.999 5，回收率达到95%～110%。该方没有解决水解后样品溶液中半乳糖和葡萄糖分离的问题，也没有确定半乳糖换算成低聚半乳糖的换算系数，推广意义不大。

1.4 离子色谱法

离子色谱法检测单糖和低聚糖是比较新的检测技术，具有灵敏度高、分离效率好等优点。离子色谱法检测低聚半乳糖首先是美国AOAC 官方公布的标准方法，其他的关于离子色谱法检测低聚半乳糖的研究主要是对AOAC 标准方法的改进研究。

1.4.1 美国AOAC 45.4.12-2001.02 标准[28]

AOAC 45.4.12-2001.02《Determination of trans-Galactooligosaccharides（TGOS）in Selected Food Products》标准，依据的理论基础是利用特定、专一的β-半乳糖苷酶水解样品中的乳糖和低聚半乳糖，产物是葡萄糖和半乳糖，再利用样品中检测出的乳糖含量计算出乳糖水解来源的半乳糖含量。最后用样品溶液中总半乳糖含量减去游离的和乳糖水解来源的半乳糖含量，然后用半乳糖增量乘以一个系数计算得到样品中低聚半乳糖（GOS）的含量。该标准的操作和计算步骤如下：

①用IC 测出游离的半乳糖和乳糖的量；

②计算乳糖来源的半乳糖的量；

③水解样品中的乳糖和TGOS；

④用IC 测出水解液中总半乳糖的量；

⑤计算GALGOS=GALT-GALfree-GALLAC；

⑥计算TGOS=k×GALGOS。

注：这里k=（180+162 n）/（180 n），n 是低聚半乳糖分子中半乳糖基的平均数。

该标准方法用于低聚半乳糖的检测存在2 个技术问题：

1）AOAC 45.4.12-2001.02 标准中的计算系数是由低聚半乳糖的聚合度计算得到的。可是在试际检测中，由于不同生产工艺造成的低聚半乳糖各组分的复杂性，低聚半乳糖的聚合度不能准确测量得到。因为没有统一的换算系数，所以该方法只能是给出了检测思路和方法，推广的意义不大。

2）因为定量依据是样品中半乳糖的增量，所以待测样品中乳糖或含有半乳糖的碳水化合物的量是影响检测结果准确性的最重要因素（该标准已经做了说明）。食品尤其是乳粉中的乳糖含量（≥40 g/100 g）远高于添加的GOS 含量（≤1 g/100 g），这样由乳糖水解来源的半乳糖含量高于20 g/100 g。而由GOS 水解得到的半乳糖含量不超过总半乳糖含量的5%，从样品处理、仪器分析的结果分析这5%增量可以计为非常好的平行结果，不能用来计算GOS 的含量，因此该方法不适用于乳糖含量高的样品。

1.4.2 其他的离子色谱检测方法

采用离子色谱法检测低聚半乳糖含量的研究基本上都是以AOAC 45.4.12-2001.02 标准为基础进行的。主要在色谱柱型号、流动相梯度和浓度、β-半乳糖苷酶的添加量等方面进行了研究，也有科研人员利用离子色谱-质谱联用进行了一些研究。

Bruggnk C et al[29]用离子交换色谱和单四极质谱串联做了一些研究，并认为该方法可以分离分析了chicory coffee、蜂蜜、啤酒样品中的单糖、二糖、三糖和低聚糖。

李建文等[30]在AOAC-2001.02 方法基础上，优化淋洗液梯度，以高效离子色谱-脉冲安培检测法测定了原料糖浆中的低聚半乳糖含量。

徐莉等[31]参考AOAC-2001.02 方法，用水、250 nmol/L NaOH 溶液和1 mol/L 乙酸钠溶液梯度淋洗，选用CarboPac PA10（2 mm×250 mm）色谱柱和安培检测器，研究了离子色谱法测定糖浆中低聚半乳糖含量的方法，测定了糖浆中各组分（乳糖、半乳糖、葡萄糖和低聚半乳糖）的含量。

2 现有方法存在的问题

2.1 样品通用性

虽然现在有很多技术进行低聚半乳糖的检测，但是主要针对低聚半乳糖原料糖浆、转化糖产物等低聚半乳糖含量较高的样品。包括AOAC 标准在内，涉及到的食品样品也主要是乳糖含量较低和半乳糖含量较低的食品样品中低聚半乳糖含量的检测。

2.2 外标法的适用性

工业化生产使用乳糖酶的来源不同，各生产企业采用的生产工艺也存在一定的差别，造成了低聚半乳糖组分种类和比例的复杂性，采用外标法检测存在标准品制备难度大、色谱分离技术要求高等技术难点，所以采用外标法进行检测方法研究的可能性不大。

2.3 经验换算系数

采用β-半乳糖苷酶把样品中乳糖和低聚半乳糖水解，通过半乳糖增量计算样品中低聚半乳糖含量，需要利用样品中低聚半乳糖中的半乳糖单元的平均数（半乳糖单元的平均聚合度）来计算得到一个换算系数。因为低聚半乳糖组分的复杂性，所以到目前为止还没有一个统一的换算系数，导致即使测得来源于低聚半乳糖的半乳糖增量，也无法计算出样品中低聚半乳糖的含量。

2.4 样品中乳糖含量

考虑到采用AOAC-2001.02 方法的思路，我们必须要检测到来源于样品中低聚半乳糖的半乳糖增量，所以如果样品中游离的半乳糖、乳糖或者含有半乳糖的低聚糖含量非常高，比如说乳制品样品，就需要解决样品中游离的半乳糖、乳糖或含有半乳糖的低聚糖的去除问题，而上述研究中都没有对这一问题进行研究。

3 食品中低聚半乳糖检测方法的研究方向

由于国际上发布的低聚半乳糖的检测方法标准只有AOAC 45.4.12-2001.02《Determination of trans-Galactooligosaccharides（TGOS）in Selected Food Products》，我们国家还没有发布低聚半乳糖检测方法的国家或行业标准。而其他的研究结果应用到食品中低聚半乳糖的测定存在较多的不足，所以食品中低聚半乳糖的检测方法研究最好以AOAC 方法为思路，重点解决以下2 个问题。

3.1 商业化低聚半乳糖分子的平均聚合度

通过对商业化低聚半乳糖原料中低聚半乳糖组分结构和比例进行研究，测定并计算低聚半乳糖的平均聚合度，进而计算得到利用半乳糖增量计算低聚半乳糖含量的换算系数，解决AOAC 方法结果计算问题。

低聚半乳糖平均聚合度的测定方法主要有高效液相色谱法、离子色谱法和质谱法。

HPLC 法可以采用聚合度分析和氨基柱分析，利用面积归一法计算出低聚半乳糖的平均聚合度。离子色谱法需要选用适合分离低聚糖的色谱柱，把低聚半乳糖原料进行很好的分离，测量每个组分的分子量（或聚合度），然后用面积归一法计算出低聚半乳糖的平均聚合度。这两种方法建立在用于研究的低聚半乳糖原料是由纯的乳糖转化而来，不能含有乳糖来源的半乳糖、葡萄糖、低聚糖以外的低聚糖，而且每一种低聚半乳糖组分都要很好的分离，还要知道每个组分的聚合度，同时假设每种组分的响应值相等，存在一定的误差。

质谱法需要对低聚半乳糖每个组分的质荷比进行测量，确定不同质荷比的离子丰度，通过每个聚合度组分的离子丰度比计算低聚半乳糖的平均聚合度。质谱法所研究的对象也应该是由纯的乳糖转化而来的低聚半乳糖，不能含有其他来源的低聚糖，还要保证乳糖和低聚半乳糖中的二糖有很好的分离，保证每个聚合度组分的离子丰度响应值相同（最重要的是每个离子的带电荷数一定要相等），也存在一定的误差。

虽然以上测定聚合度的方法都存在一定的误差，但是通过分析误差的可接受程度和测定方法的可操作性，应该可以建立与蛋白质换算系数相类似的低聚半乳糖的换算系数。

3.2 可测定样品的通用性研究

因为需要通过测定样品中的半乳糖增量来计算样品中低聚半乳糖含量，所以样品中游离的乳糖、半乳糖含量是影响测定结果准确性的重要因素，因为本底中半乳糖含量太高，通过水解后得到的半乳糖增量相对比例较低，测定误差就比较大。

研究并解决在样品前处理中去除游离乳糖、半乳糖的干扰，能够提高检测结果的准确性，提高检测方法对样品的通用性，尤其是乳制品样品。可以考虑通过固相萃取、微生物、色谱制备技术对样品中游离的乳糖、半乳糖进行去除。但是因为检测目标物和乳糖、半乳糖都属于糖类，结构相同，所以这部分研究将有比较大的难度，并且需要较大的投入。

另外，在样品前处理过程中还需要考虑样品中的带电离子尤其是二价离子对离子色谱柱的影响，需要研究这些离子的去除技术。

4 结论

虽然低聚半乳糖的检测技术研究有一定的难度，但是随着人们的生活水平不断提高，添加低聚半乳糖的食品会越来越受到消费者的重视，开发生产添加低聚半乳糖的具有益生功能的食品将是发展趋势。从当前国内的食品质量安全形式和消费者对食品质量要求的不断提高，研究开发食品中低聚半乳糖含量的检测方法显得尤为重要。研究开发并制定食品中低聚半乳糖含量的检测方法标准，不仅能够为企业提供适合的检测方法，加强产品的生产过程控制；也可以为食品质量监督检验部门提供检测方法，并可为食品中其他低聚糖成分的检测技术研究提供借鉴。

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