甘露聚糖肽生产技术研究现状

王正元，惠 明，杜小波，高春媛，张开平

（河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001）

0 前言

甘露聚糖肽曾用名多抗甲素，是一种新型生物免疫增强剂和生物反应修饰物，存在于甲型溶血链球菌荚膜和其培养液中.它可以调节机体免疫紊乱，显著增强自身免疫力，现较多用于治疗免疫功能低下或免疫障碍性疾病如反复感冒、反复呼吸道感染、白细胞减少和辅助治疗各种恶性肿瘤等[1].国内有不少研究是关于甘露聚糖肽药理作用的探索，有关其生产的研究正在随人们对甘露聚糖肽药理作用的认识而加深，但尚未见国外有在甲型溶血链球菌培养液中提取荚膜多糖的报道.甘露聚糖肽自批准上市以来，取得了较好的疗效且毒副作用小，在临床上应用越来越广泛.目前，关于甘露聚糖肽药理作用和免疫功能的综述很多，但其生产过程、发酵及提取条件优化的综述很少.作者综述了甘露聚糖肽的生产提取工艺，并结合微生物多糖提取中先进的工艺技术对现有甘露聚糖肽的发酵和提取过程进行了展望.

甘露聚糖肽为类白色或微黄色无定形粉末，无臭、无味，易溶于水，不溶于有机溶剂，是化学性质稳定且具有一定均一性的混合物，不存在单糖、双糖等小分子糖类和游离氨基酸，完全由不同链长的甘露聚糖肽分子构成，分子质量约为71 ku[2].甘露聚糖肽中总糖的含量为87.7%～90.3%，主要为甘露糖以及少量的葡萄糖残基；氨基酸总含量为4.5%～6.2%，主要为天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸和亮氨酸，其中糖链与肽链的连接有N—糖苷键连接和O—糖苷键连接两种方式[3].甘露聚糖肽可增强机体免疫机能，诱导胸腺淋巴细胞产生活性物质，升高外周白细胞数量、增强骨髓造血功能[4]，从而可减少免疫逃逸，增强免疫系统的抗病毒能力，增强机体清除异物的能力，在临床上可联合其他药物治疗恶性腹腔积液[5]、复发性疱疹[6]、疫苗无应答[7]等疾病.此外，甘露聚糖肽进入消化道后，被相应的酶分解为甘露寡糖和碱性多肽两部分[8]，其中甘露寡糖具有提升机体免疫反应[9]、吸附肠道病原菌、促进有益菌繁殖[10-11]等作用，碱性多肽具有抑菌功能[12].随着对甘露聚糖肽药理作用更深入的研究，其更广泛的临床应用有待进一步发掘.

1 甘露聚糖肽的生产

甘露聚糖肽主要由甲型溶血性链球菌通过液体深层发酵，培养液经除菌体和反复乙醇沉淀等提取纯化得到，然而胞外多糖的产量很低.通过筛选优良菌种，优化发酵条件，或对菌种进行改良可以在一定程度上提高胞外多糖的产量.胞外多糖的产量与菌种有密切关系，不同菌株合成胞外多糖的能力差别很大，而同一株菌发酵条件不同，多糖的产量也有差别.目前一些菌种的胞外多糖合成相关的基因已经被克隆与鉴定，使通过基因工程技术提高胞外多糖的产量成为可能.

1.1 发酵条件的优化

一般细菌胞外多糖的产量在接近稳定期时达到最高，到达稳定期后产量将不再增加[13].获得高产胞外多糖的最佳发酵温度与菌株培养的最适温度没有直接联系，有些菌株在较低温度时胞外多糖产量较高[13]，但并不是其生长的最适温度.一般相对较低的培养温度需要较长的培养时间，较高的培养温度需要相对较短的培养时间，Lee 等[14]在发酵生产香菇水溶性多糖中证实了这一点.pH 值也会影响菌株的生长状况和胞外多糖的产量，不同菌株和同种菌株在不同培养条件下胞外多糖合成的最适pH 值不同.很多研究证明，甲型溶血链球菌产胞外多糖的最适pH 值在7.2 左右[15]，乳酸菌则相对较低，Ayala-Hernandez 等[16]研究了乳酸菌在不同pH 值条件下的多糖及生物量，并指出在pH5.5 时产量高，Ricciardi 等[17]报道嗜热链球菌SY在pH6.4 时胞外多糖产量最高.

1.2 发酵培养基的优化

碳氮源种类、添加量显著影响胞外多糖的产量和化学组成，胞外多糖产量可随葡萄糖、乳糖和麦芽糖的加入量增加而提高，而且不同菌种的最优碳源也有明显的区别.一些研究结果也进一步验证了碳源在胞外多糖发酵中的重要性.例如，夏帆等[15]通过改良甲型溶血性链球菌液体发酵培养基为葡萄糖15%、蛋白胨3%、酵母膏7%、氯化钠5%，其葡萄糖含量从5%调至15%，发酵液中甘露聚糖肽的含量明显提高.Zhu 等[18]在研究批式发酵生产胞外多糖时，在培养对数期后期连续补加葡萄糖，考察单一碳源葡萄糖对胞外多糖产量的影响，结果多糖产量明显增高.Tallon 等[13]研究多种碳源（半乳糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖）对植物乳杆菌胞外多糖产量的影响，结果表明乳糖是最佳碳源.在培养基中加入不同种类的氮源及离子对于胞外多糖合成量也有很大的影响[19].

2 甘露聚糖肽的分离及纯化

2.1 甘露聚糖肽的分离

2.1.1 去除菌体

去除发酵液菌体的方法主要有过滤除菌和离心除菌，两种方法的选择主要依据发酵液中菌体的特性.在甘露聚糖肽生产工艺中去除菌体主要采用离心法，培养液甲型溶血性链球菌经80 ℃，恒温30～50 min 灭菌后，菌体沉降在发酵液底部，将已经灭活的细菌培养液通过连续流离心机或沉降离心机离心，收集上清液.但离心法去除菌体的效果差，离心除菌的效果依赖于高效高速离心设备的投入，且高效离心设备投资费用较高，能耗较大.

微滤是一种以多孔细小薄膜为过滤介质，膜两面的压力差使得小分子溶质和水通过滤膜的微孔，将细胞及微粒悬浮物截留下来，目前在工业中主要用于除去细胞和细胞碎片，浓缩细胞悬液.Kuiper 等[20]用微滤膜过滤啤酒酵母，其过滤通量是普通硅藻土过滤效率的40 倍.梁涛等[21]采用有机微滤膜对结冷胶发酵液进行过滤除菌试验，考察不同膜材料的过滤性能，以及结冷胶浓度、温度、压力等操作参数对除菌效果的影响，结果表明滤膜污染后采用0.75% HCl 和1% NaOH 交替清洗，可使膜通量得到较好的恢复.采用中空纤维膜或陶瓷滤膜制成的分离器在分离多糖中，以其滤膜开放式通道的特性，可以处理复杂组分的混悬液，且菌体截留率高，步骤简单，可反复利用，造价低和便于维护管理[21-22].

2.1.2 收集总甘露聚糖肽

目前在甘露聚糖肽生产工艺中沉淀总多糖采用水提醇沉法，将去除菌体的培养液进行浓缩，然后在浓缩液中加入乙醇，使乙醇含量分别达到50%、60%、70%不等，即可逐级沉淀出不同分子质量的甘露聚糖肽；也可使乙醇含量达到较高浓度，沉淀出总的甘露聚糖肽分子，将总甘露聚糖肽进行蒸馏水溶解，调整pH、离心，再进行乙醇沉淀，可进一步纯化甘露聚糖肽；如此反复提取可获得符合标准含量的甘露聚糖肽.但水提醇沉法收集总甘露聚糖肽得率低，在进行乙醇沉淀时要保持较低温度进行，且反复醇沉次数不宜过多，以免药品生物活性成分降低，而且纯化过程中乙醇消耗量大，工艺步骤繁琐.

超滤是一种新型膜分离技术，是以超滤膜的选择性筛分性能来分离、提纯和浓缩物质.目前已在中药药品生产过程中广泛应用，通过采用不同孔径的截留膜，从而达到去除分子质量大的无效成分的目的.王斌等[23]采用超滤法提取裂褶菌胞外多糖，并对超滤条件进行了优化，可制得纯度为75.13%的裂褶菌胞外多糖，收率可达82.06%.Albani 等[24]采用超滤方法改进了流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化工艺，并实现了多糖分离过程的简单、经济、高效、环保，易扩大规模.本实验室使用不同孔径的滤膜对甘露聚糖肽水溶液截留，取得了较好的浓缩纯化效果.将超滤技术用于食药用菌多糖这种生物活性物质分离，具有不降低药品活性、无污染、分离效率高、设备简单、可连续生产等优点[25].

2.2 甘露聚糖肽的纯化

2.2.1 去除蛋白质

多糖提取液脱蛋白的主要方法有Sevage 法、三氯乙酸法、盐酸法、阴离子交换树脂法等.目前甘露聚糖肽生产工艺中去除蛋白质采用盐酸法，因稀酸提取的多糖具有较高的生物活性.在粗甘露聚糖肽沉淀的水溶液中加入盐酸，调整溶液的pH 为1.5～1.7，并保持温度在4 ℃左右，静置12 h，然后离心去除蛋白质.虽然酸沉淀可以去除部分蛋白质，但处理过程中要保持低温，以减少多糖肽在酸性条件下的分解.Sevage 等[26]有机溶剂去除蛋白质的方法也可导致多糖较高的损失率，且损失率随抽提次数的增加而增大.

离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换介质中可交换的离子进行交换而达到分离纯化的方法.目前已广泛用于各学科领域，在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽、蛋白质、多糖及核酸等物质.张燕等[27]用离子交换层析纯化的肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖具有较高的免疫生物活性.Takano 等[28]在检测氨基酸组分的过程中用阳离子交换层析作为检测复合物的预处理，取得了较好的效果.离子交换树脂法能有效地去除蛋白质，经检测，离子交换树脂处理后的多糖洗液中蛋白质的脱除率达90%以上[29]，而多糖损失率却很低，具有较好的应用前景.

2.2.2 内毒素（LPS）含量控制

内毒素可引起动物和人发热、机体微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等不良症状，影响了药品的临床疗效，在药品生产中其含量应严格控制.目前医药行业去除内毒素的方法有活性炭吸附、Tritonx-114 萃取[30]、超滤[31]、离子交换色谱等选择性去除内毒素的方法和亲和层析等非选择性去除内毒素的方法.

在甘露聚糖肽现有的生产工艺中，由于内毒素与甘露聚糖肽在乙醇中是共沉的，无法用乙醇沉淀除去，去除内毒素依旧沿用活性炭吸附的方法[32].活性炭以其较大的比表面积，具有很强的吸附能力，但由于其吸附不是选择性的，因而不可避免地吸附了药物中的生物活性物质，造成药物有效成分的损失.

溶液中内毒素含量较高时，在水相环境中内毒素形成高分子聚合物，分子质量大于300 ku，可控制滤膜的截留分子质量来去除小分子溶液中的内毒素，该方法要求溶液中的小分子物质的分子质量与内毒素分子质量差别较大，甘露聚糖肽平均分子质量为71 ku，能够用超滤的方法去除内毒素.向溶液中加入Ca2+将有助于加速LPS 聚合物的形成，提升超滤效果[33].由于LPS 带负电荷，因此可以选用阴离子交换树脂从碱性物质中去除内毒素，且成本低，吸附量大[34].

根据内毒素的特殊结构，选择适当的配基[35]，并将其固定于亲和色谱的基质上合成亲和介质，即可制成高选择性、高效能的LPS 吸附剂，可去除溶液中残余的微量LPS，相对于非选择性去除方法，亲和色谱层析具有较高的优越性.将组氨酸作为配基固定于中空纤维膜上，可有效清除溶液中的微量LPS[36].多黏菌素B 对LPS 的类脂A 有亲和作用，可选择多黏菌素B 作为配基，固定于介质上去除药物中的内毒素[37].这种亲和色层析的方法条件温和，操作方便，对大分子成分注射剂中的LPS 去除，有着明显的优势，为去除甘露聚糖肽注射液中微量的LPS 指明了一个新的方向.

3 展望

近年来，甘露聚糖肽作为一种新型生物免疫增强剂，临床需求量不断扩大，为提取分离工艺提出了更高的要求.这就需要从各方面进行研究，包括方法创新、育种技术和发酵工艺的改进等.在发酵条件优化方面选择合适的碳氮源及发酵温度、pH 等都可促进胞外多糖的产量，采用基因工程技术建立胞外多糖的高产表达体系将是下一步的研究热点.在提取纯化方面，微滤、超滤等膜处理技术和层析技术的广泛应用将推进胞外多糖的生产进行革命性的改变.膜处理技术可直接从液体中分离、浓缩特定分子质量的多糖物质，其工艺有操作简单、收率高，可避免药品中活性成分的损失，减少有机溶剂的使用和避免二次污染等优点.以高效的去除蛋白质技术与超滤技术结合[38]是目前创新的亮点，在香菇多糖提取中已得到应用，效果较好.将多学科先进技术进行融合，并应用在甘露聚糖肽生产过程中可以更好地解决其提取纯化工艺中的问题，进一步提高甘露聚糖肽的产量.

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