牛支原体病诊断方法的研究进展

蒋 勇，周 蓓，黎晓敏

（西南大学动物科技学院，重庆 400715）

牛支原体（Mb）是一类没有细胞壁、介于细菌和病毒之间、能进行自我复制、独立生活的简单和极微小的原核微生物，是引起牛肺炎、关节炎、乳房炎、流产与不孕等多种疾病的主要病原之一。牛支原体菌是在1961年首次从美国患乳腺炎病牛中分离获得，而我国2008年首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体，此后开始在我国蔓延[1-2]。由于牛感染牛支原体后的临床症状和病理剖检变化与传染性胸膜肺炎非常相似，因而，实验室检测对于该病的准确诊断具有重大意义。并且牛支原体继发或混合感染其他病原体时，临床症状加重，甚至死亡率增加。因此，有效预防控制和准确诊断对于我国牛养殖业至关重要。

1 临床诊断

感染牛支原体病的牛出现体温升高、慢性咳嗽、气喘、伴有清亮或脓性鼻汁。严重者食欲减退，被毛粗乱无光，生长受阻，并出现粪水样或带血粪便。有的患牛继发乳腺炎、关节炎、结膜炎，甚至出现流产和不孕。该病发病率高，治疗不当或不治情况下死亡率增高，与其他细菌或病毒混合感染时造成牛支原体病临床症状复杂化，而且有些感染牛出现隐性感染，不表现出临床症状[2]。因此，通过临床症状只能怀疑感染牛支原体病而不能作出准确判定。

2 病理学诊断

剖检病理变化主要在肺脏和胸腔。有些病牛伴有不同程度的肺和胸膜黏连，并有少量积液。轻者可见肺尖叶、心叶及部分膈叶有局部红色肉变，而且有些会出现化脓。严重者肺部多部位出现坏死灶，切开为干酪样。

3 病原体检测技术

3.1 病原分离培养

通过改进分离培养基分离方法，按照实验室规范操作接种病料于培养基上，5%CO2培养箱中培养3～4 d，牛支原体在固体培养基上具有典型的“煎蛋样”圆形菌落特征，边缘整齐，表面光滑，中间厚周边薄，可见菌膜斑点；加入酚红液体培养基中颜色由红变黄，而且液体透亮。此分离方法从病变部位分离牛支原体分离率增高，但由于牛支原体分离培养难度大、稳定性差、培养时间长、灵敏度低，还不能作为牛支原体感染快速诊断的方法。

3.2 免疫酶技术

酶联免疫过氧化物（ELIP）和间接免疫过氧化物酶试验用于检测病肺中的牛支原体，克服了荧光抗体技术检测慢性感染牛不敏感、需要新鲜样本和荧光显微镜以及样品不能长期保存的缺点。用免疫酶技术检查肺切片和涂片时，支原体被染成淡红褐色的多形态颗粒，反应很稳定。目前该方法在检测猪、羊等支原体肺炎病时较常用，而用于牛支原体检测只见有少量相关报道。

3.3 免疫组化技术

免疫组化是一种特异性强、敏感度高的病原鉴定方法。该方法可以检测到牛支原体抗原在机体的分布状态，分离培养表明，牛支原体存在但病原培养又为阴性时，免疫组化技术就可以辅助分离培养定性鉴定牛支原体的存在。在干酪样坏死性支气管肺炎中，免疫组化显示牛支原体抗原广泛分布于坏死灶周围；抗原主要存在于巨噬细胞的胞浆内，同时也存在于肺泡和支气管腔内的各种白细胞以及淋巴细胞内。虽然免疫组化法特异性强，敏感度高，但只能针对局部小块病变组织，如果病灶选择偏差或病情轻微时，免疫组化将很难检测到病原体。

4 免疫印迹法

免疫印迹是以免疫覆盖液为检测探针，对抗原或抗体进行印迹分析的通称。蛋白质印迹中由于引进了血清学检测技术，使结果的分析更加准确、细致。Thomas等通过对分离菌株表面膜蛋白分析，发现所有分离菌株Vsp蛋白表达具有高度的差异性[3]。Ghadersohi等通过将无乳支原体、牛生殖道支原体、精氨酸支原体以及牛支原体全细胞膜蛋白转移到硝酸纤维素膜进行免疫印迹分析，发现牛支原体具有独一无二的单克隆E4蛋白[4]。

5 核酸诊断技术

从牛支原体DNA中准备一个SauⅢA消化的基因组库，克隆到pUC19，再用准备好的纯化牛支原体DNA探针克隆杂交确定杂交的程度[6]。牛支原体的DNA片段就从EcoRⅠ和HindⅢ消化的重组质粒中重新取回。而这种从牛支原体、无乳支原体、牛生殖道支原体、羊肺炎支原体以及不同种属的精氨酸支原体中取出的固定化DNA可以随意用来进行引物探针斑点杂交分析。除牛支原体和羊肺炎支原体DNA外，其他都被发现有杂交迹象。此方法敏感性高、特异性强，但需进一步结合PCR作出准确的结果判定。

6 PCR诊断技术

多聚酶链式反应（PCR）诊断鉴定方法可缩短牛支原体的鉴定时间，解决牛支原体培养和鉴定难、费时的难题，使牛支原体在实验室诊断鉴定中显得更加准确、方便、快捷。近年来，国内外对牛支原体PCR诊断鉴定研究众多，除普通PCR外，套式PCR、多重PCR、巢式PCR、RT-PCR等鉴别技术也是PCR诊断技术的研究重点。

基于牛支原体和牛无乳支原体16S rRNA同源性高的特点，Subramaniam等、Bashiruddin等分别使用UvrC基因特异序列和牛支原体oppD/F基因进行PCR扩增[5-6]。而李媛等基于oppD/F基因序列对引物进行改良，建立了牛支原体套式PCR检测技术，提高了PCR方法敏感性，避免了非特异性的产生[7]。李大伟等根据牛支原体、丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体3种病原的基因组序列保守区域设计3对特异性引物建立三重PCR方法，与牛支原体分离培养检测结果一致，但敏感性低于单一PCR[8]。Foddai等基于牛支原体p81基因序列设计建立了多重PCR和PCR-RFLP诊断技术，成功鉴别牛支原体和无乳支原体，而且特异性更强，灵敏度更高[9]。此外，Pinnow等建立了特异的巢式PCR鉴定方法，该方法可以鉴定用防腐剂处理过的牛奶样品[10]。Thomas等通过对20株牛支原体uvrC基因测序，并利用PCR扩增到92株，证明了uvrC基因是PCR诊断牛支原体的保守序列[11]。

7 血清学抗体检测技术

目前可用于牛支原体的血清学试验有血球吸附试验、放射免疫扩散测定、沉淀反应试验、荧光抗体技术试验、补体结合试验、间接血凝试验、凝集试验以及酶联免疫吸附试验等，其中用全细胞或抗原处理的间接酶联免疫吸附试验（ELI⁃SA）是现在最为有效的检测方法。

ELISA主要用于牛支原体感染的血清学流行病评估及其暴发流行检测，同时也用于检查牛群感染状态的检测。在欧洲以及北美已普遍用于牛奶中抗M.bovis抗体诊断检测，这使得检测M.bovis的感染部位成为可能，其有效性和敏感性比传统鉴定方法有所提高。Byrne等采用间接ELISA对奶牛场乳腺炎牛支原体感染及牛支原体组织样品滤过液进行病原学调查[12]。制备牛支原体特异性单克隆抗体，并建立一个夹心ELISA方法来检测培养基中是否有牛支原体抗原存在，目前已经成为商品化诊断产品。此外，其他ELISA方法也可以用于建立识别抗M.bovis特异蛋白抗体，如利用重组Vsp蛋白或无乳支原体P48蛋白的同源物——膜脂蛋白作为目标抗原[12]。有研究表明，P48蛋白抗血清能识别所有待检的牛支原体，同时不与牛群中其他的同型支原体交叉反应，说明应用P48蛋白建立的ELISA实验能用于M.bovis感染的一种特异性标记。并且利用VspA重组蛋白作为包被抗原建立ELISA的检测方法可检出自然感染和试验感染动物血清中的特异抗体。目前，比利时、美国、加拿大、瑞士等国已经成功生产出商品化的牛支原体血清抗体检测试剂盒。而在我国，由于牛支原体研究起步晚，市场上虽有商品化的牛支原体血清抗体检测试剂盒，但是检测灵敏度以及精确性有待进一步提高。

8 结语

我国是传统养殖大国，牛、羊养殖对畜牧业发展起着重要作用，牛支原体病严重威胁着我国养牛业健康快速发展。探索高效、快速、特异的检测手段对于牛支原体疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。近年来，牛支原体病引起我国学者广泛关注与重视，然而，现阶段我国对于牛支原体的研究尚处于起步阶段，因此需要深入研究牛支原体的免疫机制、流行病学、致病机理，开发有效疫苗和疾病诊断试剂盒，有效防控牛支原体病，保障养牛业的健康快速发展。

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