虾类免疫因子的研究进展

■郭 慧 冼健安 毕建柱 叶超霞 王安利

（华南师范大学生命科学学院，广东省水产健康安全养殖重点实验室，生态与环境科学广东普通高校重点实验室，广东广州510631）

虾类蛋白质丰富、营养价值高且具有很高的经济价值，虾类养殖业从20世纪中叶就在全球广泛兴起，在水产养殖业中占有极为重要的地位，尤其是近年来特种水产养殖业的兴起，使虾类的身价倍增。据联合国粮食及农业组织统计，全世界海水和微咸水养殖的对虾产量从1970年的8 987公吨增加到2006年的3 146 918公吨。随着养殖规模的扩大和水域生态环境的恶化，导致了各种各样对虾疾病的暴发，据估计，20世纪90年代以来，疾病给对虾养殖业造成的经济损失高达10亿美元。

由于虾类疾病带来巨大经济损失，虾类免疫学研究成为近年来研究的热点，研究结果为虾类的病害防治提供了坚实的理论基础，为虾类养殖业的可持续稳定发展提供了保障。随着EST技术、基因芯片杂交、SSH和蛋白质组学在虾类免疫学研究中的应用，越来越多的免疫因子被发现，这些免疫因子协同作用在虾类免疫系统中发挥着重要的作用。本文对虾类免疫系统中重要的免疫因子进行综述，以期为更深入的研究和应用提供参考。

1 虾类的免疫系统

无脊椎动物（包括甲壳类动物）的先天免疫系统分为细胞免疫和体液免疫。细胞免疫是指对虾通过血细胞将外界抗原物质吞噬、包裹、溶解、排出，达到清除异物的目的。体液免疫是通过体液免疫因子实现对抗原的识别、凝集、溶解、或者直接把病原微生物杀死。两种免疫之间既有各自独特的作用，又可以相互配合，共同发挥免疫效应。免疫反应的过程主要包括免疫识别、信号传导以及免疫效应物质介导的效应反应。

一般认为，甲壳动物的免疫主要为非特异性免疫，其体液不具有免疫球蛋白，体液免疫主要是依靠血淋巴中的一些非特异性的酶或因子来进行的，这些因子包括抗菌肽、溶菌酶、凝集素等。还有一些免疫因子不能直接对抗原起作用，而是通过调节和诱导免疫反应，如酚氧化酶原级联反应（prophenoloxidase cascade，proPO）、凝结反应（clot⁃ting cascade）和炎症反应，或是通过调节细胞的状态，起到防御的作用，这些防御因子包括丝氨酸蛋白及其抑制剂、热休克蛋白、硫氧还蛋白、与细胞凋亡的蛋白等。根据EST技术、基因芯片杂交、SSH和蛋白质组学分析的研究结果，参与免疫识别的几类基因，主要集中在体液免疫反应和细胞免疫反应。因此，对虾免疫机制的研究主要集中在这些免疫相关因子及相关的反应上。

2 虾类的免疫因子

2.1 凝集素

凝集素（lectin）是一类能结合糖的蛋白，在蛋白质转运、细胞信号传导、病原体识别和作为效应器分子等生物过程中扮演重要的角色。其最大的特点是能专一地、非共价地识别糖蛋白或糖脂的末端糖残基，如脂多糖、肽聚糖、β-1,3-葡聚糖、甘露聚糖、脂磷壁酸等，因此，凝集素是模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)的主要参与者，它们的作用与脊椎动物的补体类似。在甲壳动物中，凝集素被视为一个在免疫识别和吞噬过程中有调理作用的潜在分子。凝集素按分子结构可分为C型凝集素、S型凝集素、P型凝集素、I型凝集素和Pentraxins。据报道，在大多数对虾品种中都有不同C型凝集素的存在。从中国对虾血细胞中克隆出的C型凝集素FcLectin，cDNA全长为1 482 bp，包括一个861 bp的开放阅读框，编码287氨基酸，含有两个糖识别域（carbohydrate rec⁃ognition domain，CRD）。在受到细菌、脂多糖或WSSV刺激后其转录表达发生明显的变化。随后又从中国对虾肝脏中分离出了5种C型凝集素，分别是FC-HSL、FC-LEC2、FC-Lec3、FC-Lec4、FCLec5。其中FC-HSL的cDNA全长为571 bp，含有一个480 bp的开放阅读框，可编码一个由159个氨基酸残基组成的蛋白质。细菌或病毒感染后，FC-HSL的表达明显上调。最近从克氏原螯虾肝脏中分离出了一种C型凝集素PCLT，在感染溶藻弧菌和WSSV后，PCLT的表达明显上调。同时，该研究结果表明，PCLT不仅是模式识别受体（PRR），而且还充当免疫调节因子，能通过调节血淋巴液中的细胞黏附蛋白、酚氧化酶、超氧化物歧化酶等免疫因子，以激活该基因并使其表达量上调来参与宿主防御异物的免疫反应。越来越多的实验证明，凝集素不仅在对虾先天免疫防御中扮演重要的角色，而且在其他的非特异性免疫反应中充当调节因子，调节其他免疫因子活性，共同对机体执行不同的免疫防御作用。

此外，凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）、日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）中，都有C型凝集素的研究。

2.2 脂多糖与β-1,3-葡聚糖结合蛋白

脂多糖与β-1,3-葡聚糖结合蛋白（Lipopoly⁃saccharide and β-1,3-glucan binding protein，LG⁃BP）是一种多功能的血浆因子，它能够识别革兰氏阴性菌的细胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和真菌的细胞壁成分β-1,3-葡聚糖（β-1,3-glucan，βG）。LGBP作为一种模式识别受体，在甲壳类动物的先天免疫中发挥重要作用。目前，已从南美白对虾（Penaeus stylirostris）、斑节对虾（Penaeus monodon）、凡纳滨对虾中分离出该蛋白。凡纳滨对虾的LGBP上发现具有细胞黏附肽RGD（Arg-Gly-Asp）、β-(1-3)多糖键识别位点，同时还有2个膜整合蛋白（integrin）结合域。当对虾被细菌感染时，LGBP的表达水平显著上升，表明LGBP在细菌病原体的识别过程中扮演重要的角色。研究发现，斑节对虾的LGBP（PmLGBP）作为一种模式识别受体，参与虾类的酚氧化酶原系统，它识别结合病原体的脂多糖和β-1,3-葡聚糖后激活酚氧化酶原激活系统（Prophenoloxidase-activat⁃ed system，proPO-AS），以此防御病原体的感染。实验表明，重组PmLGBP（rPmLGBP）在脂多糖或β-1,3-葡聚糖存在下可提高血细胞悬液中的酚氧化酶（PO）的活性。

2.3 Toll样受体

Toll样受体（TLRs，Toll like receptors）能特异识别病原相关分子模式（PAMP），是一类在先天免疫和获得性免疫中都发挥重要作用的蛋白质。Toll样受体家族是进化中比较保守的一类免疫识别受体，在对抗病原微生物感染、引发免疫和炎症反应中发挥着重要作用。目前已确认的Toll样受体家族成员至少有13种，分别命名为TLR1～TLR13。在对虾中，也分离出了几类Toll样受体。第一个Toll样受体是从凡纳滨对虾中分离出来的LvToll，它编码了926个氨基酸残基，包含了Toll受体家族的特征区域，即富含16个亮氨酸的重复序列的胞外区和含有保守TIR的结构域（Toll-Interleukin-1 receptor domain）。凡纳滨对虾Toll样受体中结构域第1～125和34～158个位点的氨基酸序列与斑节对虾、赤拟谷盗和果蝇TIR基因序列有较高的相似性。说明无脊椎动物对抗病原体的先天免疫机制与脊椎动物具有相似性且起源一致。中国对虾中克隆出来的Toll样受体FcToll编码931个氨基酸残基，包含5个外显子和4个内含子。FcToll在不同组织中都有表达，但主要表达在淋巴器官中，在细菌或病毒刺激后，FcToll的表达模式发生了明显的变化。

2.4 四次跨膜蛋白

四次跨膜蛋白（Tetraspanin/TM4SF）是一种在真核有机体中广泛表达的超家族成员。有研究指出，四次跨膜蛋白分子可能与几种Ig家族的蛋白相联系，在免疫反应中起作用。为了解四次跨膜蛋白在对虾免疫系统中的作用，从中国对虾中克隆出了四次跨膜蛋白家族的三种基因，分别是CD9、CD63和tetraspanin-3，它们具有四次跨膜蛋白特有的氨基酸序列。这三个基因均在对虾不同的组织中表达，CD9（FcCD9）在肝中特异性表达，CD63（FcCD63）在神经、表皮和心脏中表达量最高，而tetraspanin-3（FcTetraspanin-3）在肠道中的表达量和表达丰度都是最高的。当对虾感染WSSV后，这三种基因在对虾组织中的表达量均显著上调。

2.5 溶菌酶

溶菌酶（Lysozyme）又称胞壁质酶（Murami⁃dase），是一种广泛存在于各种动物体内的一种碱性蛋白，是机体先天免疫系统中的一个重要免疫效应分子，能水解革兰氏阳性细菌细胞壁黏性多肽中的乙酰氨基多糖，从而损伤细菌的细胞壁，最终使细胞崩解，从而实现机体的免疫防御。近年来，陆续从中国对虾、日本对虾、凡纳滨对虾等甲壳动物体内检测到溶菌因子的存在。研究表明，正常中国对虾的血淋巴中具有较强的溶菌活力，而濒死中国对虾血淋巴的溶菌活性基本丧失，因此，认为溶菌活力可作为检测对虾机体免疫功能状态的一个有价值的参考指标。

2.6 酚氧化酶(PO)及酚氧化酶原激活系统

在无脊椎动物中，PO一般以无活性的酶原-酚氧化酶原proPO的形式存在，无活性的proPO在丝氨酸蛋白酶的作用下转变成有活性的PO。酚氧化酶原激活系统(Prophenoloxidase-activated sys⁃tem，proPO-AS）是由proPO、PO、模式识别蛋白和多种丝氨酸蛋白酶及其抑制剂构成的一个复杂的级联反应。这一过程类似于高等动物的补体激活途径。

2.6.1 丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶(Serine protease，SP)是一种重要的蛋白水解酶，广泛存在于动物、植物、微生物中。SP及其同源物参与无脊椎动物的先天免疫，包括淋巴凝血、细胞黏附、抗菌多肽和黑色素的合成。PRRs对病原体的识别可激活SP级联反应。从中国对虾中克隆出了一种丝氨酸蛋白酶（FcSP）和丝氨酸蛋白酶同源物（FcSPH）。FcSP主要分布在血细胞中，而FcSPH蛋白在鳃和胃中有表达。FcSP蛋白在正常的虾体中会有局部裂解，而Fc⁃SPH蛋白是在对虾感染鳗弧菌后才会裂解。表明丝氨酸蛋白酶和其同源物可能参与丝氨酸蛋白酶级联反应，并在对虾的先天免疫中发挥重要作用。

2.6.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂

丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin，SPI）与SP一起参与蛋白酶级联反应，proPO-AS由SP级联反应介导的，而SPI在调节SP活力方面发挥了重要作用，因此，整个proPO-AS是由SPI调控的。从中国对虾的血细胞中克隆出的SPI（FC-serpin）RT-PCR检测表明，FC-serpin主要在血细胞和淋巴器官中表达。细菌和病毒感染后，FC-serpin的表达量大幅度变化。表明FC-serpin可能在对虾先天免疫中发挥潜在的作用。

2.6.3 proPO

proPO是一个黑色素合成酶，是节肢动物中一个重要的免疫蛋白。甲壳动物血细胞内的proPO能够被一些蛋白或微生物多糖激活(如LPS、βG或PG)，而转变成有活性的酚氧化酶(PO)。截止目前，在螯虾、凡纳滨对虾、斑节对虾中都有关于proPO的报道。用RACE技术从中国对虾血细胞中克隆出了proPO基因，研究表明，proPO在血细胞、淋巴器官和肝中都有表达，且血细胞中ProPO基因的表达水平最高。感染鳗弧菌后，proPO在血细胞中的mRNA表达水平明显上调，说明proPO在对虾的免疫系统中扮演重要的角色。

2.7 抗菌肽

抗菌肽(AMPs)是生物体产生的一类小分子多肽，对真菌、细菌等病原微生物具有抑制或杀灭作用，通常被称为“第二防御体系”。相关研究结果表明，当细菌、真菌或者病毒病原体侵染机体后，甲壳类动物通过相关的信号传导系统激活先天免疫系统中的体液免疫反应，然后导致相关抗菌肽分子以及抗病毒因子的上调表达，来对抗病原体的侵染。1997年，首次从凡纳滨对虾血细胞和血浆中分离出几种抗菌肽，测定其中三种氨基酸序列，首次报道了甲壳动物抗菌肽的氨基酸全序列。此后，由于抗菌肽具有杀灭病毒和细菌的功能，越来越受到重视，并有望应用于水产养殖中。截止目前，在虾类中已有多种关于抗菌肽或蛋白质的报道。研究发现，蓝虾的抗菌物质由颗粒细胞产生，在注射外源微生物后的12 h内，颗粒细胞转移到病灶处,经脱颗粒和随后的细胞裂解释放大量抗菌物质，在凡纳滨对虾中也发现了类似的情况。已确定对虾抗菌肽3（CH-penaeidin）的cD⁃NA全长能编码71个氨基酸残基，主要在血细胞中表达。重组的CH-penaeidin在毕赤酵母中表达。在感染某些革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌时，它表现出活性，但在感染真菌时表现出相对较低的活性。

2.8 血蓝蛋白

血蓝蛋白（Hemocyanin）是一种多亚基的蛋白复合体，是节肢动物和软体动物血淋巴的重要组成部分，占甲壳动物血清总蛋白的60%～90%，最新的研究发现，它不但作为氧气载体为动物提供充足的氧，还具有防御病原体的功能，说明血蓝蛋白是一种相当重要的潜在免疫分子。研究发现，南美白对虾的血蓝蛋白与凝集素都具有凝集功能，可使鱼、鸡、鼠和人的红细胞以及8种虾类病原菌发生凝集作用，但其凝集活性比一般的凝集素要低。同时还发现，凡纳滨对虾的血蓝蛋白的C端存在一个Ig样保守结构域，该结构域与人Ig具有高度同源性，而且空间结构也相似，从而证明血蓝蛋白也是免疫球蛋白超家族(immunoglobulin su⁃perfamily，IgSF）成员之一。由此说明，血蓝蛋白在对虾的先天免疫中可能发挥重要作用，为对虾血蓝蛋白免疫因子基础的阐明提供科学依据。此外，血蓝蛋白裂解产生的一些抗菌肽和酚氧化酶血蓝蛋白裂解产生的抗微生物肽也与免疫反应有关。凡纳滨对虾体内注射哈维氏弧菌后，血淋巴和肝脏中血蓝蛋白mRNA表达量上调，说明病原体感染对虾后启动机体合成血蓝蛋白，新合成的血蓝蛋白主要执行酚氧化酶等免疫功能，与其它免疫因子协同作用参与机体的免疫反应。从日本对虾血淋巴中分离出的血蓝蛋白复合物可延迟WSSV的感染，这不仅说明血蓝蛋白在抵御病原体时发挥了重要作用，同时也表明血蓝蛋白的两种亚基PjHcL和PjHcY可能在对虾先天免疫系统中有不同的功能。

2.9 伴侣蛋白

热休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）是热休克蛋白家族中最重要的一类家族成员，它参与了多种生物免疫应答过程，而且在许多疾病治疗上有很大的潜力。在中国对虾中克隆出了一种HSP70家族的成员GRP78（命名为FcGRP78），当对虾受到WSSV病毒感染后，该蛋白在血细胞、肝胰脏和淋巴器官中有差异表达，说明FcGRP78作为一种伴侣蛋白，可能在蛋白质折叠和对虾的免疫功能中扮演重要的角色。目前，在克氏原鳌虾(Procambarus Clarkii)、日本对虾、中国对虾等虾类中都有关于热休克蛋白的报道。

2.10 抗氧化酶系统

抗氧化酶是无脊椎动物机体非特异性免疫的一个重要方面。超氧化物歧化酶（Superoxide dis⁃mutase，SOD）是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为O2和H2O2的酶。超氧化物歧化酶是抗氧化系统中起关键作用的酶，不仅具有清除体内自由基的作用，而且在机体免疫调节中具有重要的作用。它一般需要金属离子作为共同反应因子来进行歧化反应。有报道表明，甲壳动物除了利用血蓝蛋白作为主要的氧气输送中心外，还有一种锰超氧化物歧化酶（MnSOD）。过氧化氢酶（cat⁃alase，CAT）广泛存在于各类生物体中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理，其主要作用是消除过多的过氧化氢和维持细胞正常的氧化还原平衡。目前，已经在对虾中克隆出了过氧化氢酶的序列并对其抗氧化功能进行了研究。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）是机体内广泛存在的过氧化物分解酶，可催化谷胱甘肽（GSH）参与过氧化反应，清除细胞内的过氧化物和羟自由基。它的表达上调跟环境污染物直接相关，因此被作为一种重要的生物标记。Liu等从凡纳滨对虾中克隆了GPx基因，并发现其在受到细菌感染后基因表达有所上调。另外，中国对虾中也有GPx的报道。Wang等对pH值应激下凡纳滨对虾血淋巴中MnSOD、CAT、GPx的基因表达进行研究，结果表明，酸性或碱性诱导可导致DNA损伤并激活Mn⁃SOD、CAT、GPx的基因表达。

2.11 抗脂多糖因子

抗脂多糖因子（Antilipopolysaccharide factor，ALF）是一个小的碱性蛋白，最初是在鲎的阿米巴状细胞中分离出来的。它结合脂多糖并中和由脂多糖诱导的鲎阿米巴状细胞溶解物的凝胶化。2005年，从中国对虾血细胞中克隆出了一个抗脂多糖因子家族的抗菌蛋白基因（暂命名为ALFFc）。ALF的cD⁃NA全长为600 bp，其中包含有一个369 bp的开放阅读框，能编码123个氨基酸。ALFFc主要在血细胞中表达，当对虾在感染弧菌后，ALF转录水平的表达明显上调。这为了解ALFFc在对虾先天免疫中的功能提供了理论基础。

2.12 QM蛋白

QM蛋白是一个转录辅助因子，可抑制AP-1转录因子的活性，也是参与蛋白质合成的核糖体蛋白。利用抑制性消减杂交（suppression subtrac⁃tive hybridization，SSH）技术从日本囊对虾中获得了一段与QM同源性较高的基因片段，用RACE技术获得了QM基因全长cDNA序列，将其命名为PjQM。该基因包含一个长度为663 bp的开放阅读框，预测编码221个氨基酸。当对虾受WSSV病毒感染4 h后，PjQM的转录即出现上调表达，在感染72 h后其表达水平约为正常对虾的150%，说明对虾QM基因参与了对虾的抗病毒免疫过程。当感染细菌和病毒后，日本对虾和皱纹盘鲍鳃中的QM基因也出现上调表达。这表明QM蛋白通过参与无脊椎动物的酚氧化酶原激活系统，以此防御细菌和病毒的感染。

2.13 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotin⁃amide adenine dinucleotide phosphate(NADPH)ox⁃idases，Noxes）是一种能催化氧气和NADPH生成超氧化物的酶，具有复杂的结构。利用RACE技术从日本囊对虾中获得Nox基因的cDNA全长为4 216 bp（命名为MjNox），是第一个从甲壳类动物鉴定和克隆得到的NOX家族成员。当健康对虾受到弧菌或聚乙烯刺激后，MjNox在淋巴器官、肝和血细胞中高效表达，并在刺激4 h后达到最高表达量，12 h后下降到正常水平。这表明MjNox可能在细胞增殖、炎症反应和免疫保护反应中具有一定功能。

3 展望

虾类的免疫系统是由血细胞和其产生的免疫因子组成的一个高度复杂的网络。目前，绝大多数的工作都集中在克隆一些重要基因以及分子水平上的表达和功能的研究。免疫稳态是对虾先天免疫系统中维持不同免疫途径的平衡必不可少的，目前我们对免疫稳态的相关知识还知之甚少，与体液免疫反应相比，对虾的细胞免疫反应的研究也十分有限，因此有关虾免疫学的知识还不是很健全。随着分子生物学技术，如SSH、EST、蛋白质组学在对虾免疫学中的应用，更多未知的免疫相关因子将被发现，随着这些免疫因子功能的进一步挖掘，虾类免疫系统将逐步被探明，为虾类的病害防治提供理论基础，促进虾类养殖的健康持续发展。

（参考文献73篇，刊略，需者可函索）