纳米羟基磷灰石在胶质瘤治疗中的应用进展

郭国财，王 超，姚维成

(青岛大学附属医院，山东青岛266000)

纳米羟基磷灰石(nHAP)是一种优质的医用生物材料，除具有羟基磷灰石(HAP)良好的生物活性及组织相容性外，还有其特性，特别是广谱的抗癌作用。人脑胶质瘤是最常见的神经系统恶性肿瘤，病死率、复发率高。本文综述nHAP在胶质瘤治疗中的应用进展。

1 胶质瘤的现状

胶质瘤预后差，近年来发病率有上升的趋势。有资料显示，胶质母细胞瘤经确诊后1年生存率为30%左右，平均生存期53周左右，手术及放化疗后，平均生存期也仅为 14．6 个月左右［1，2］。目前，恶性脑胶质瘤的标准治疗方案是手术争取全切后辅以放疗和化疗。恶性脑胶质瘤因其浸润弥漫性生长，或位置深在，或累及重要功能区，往往不能被完全切除。而且，由于多数胶质瘤细胞的基因特性和血脑屏障(BBB)的存在，使放疗和化疗效果差。近年来，大量的辅助治疗方法如基因治疗、免疫治疗及靶向治疗等被应用，并且取得了一定的疗效。

2 nHAP的性质

HAP是一种含有氢氧化物离子的磷酸钙盐，是人体骨、牙齿无机物的主要成分。HAP与人体骨骼晶体结构基本一致，为六方晶系，呈弱碱性，微溶于水，易溶于酸，难溶于碱。HAP是一种强离子交换剂，分子中的钙离子容易被镉、汞、锶、钡等金属离子置换，还可与含有羧基的氨基酸、蛋白质、有机酸等发生反应。HAP的许多特性与其粒径大小和晶体形态密切相关。

nHAP表现出更优越的性能。nHAP具有溶解度高、均匀分散良好、吸附性强和生物亲和性等特质，有更好的生物活性、组织相容性和化学稳定性。大量的生物相容性研究已证实，nHAP无毒、无刺激、不导致过敏反应、不导致溶血、不导致突变、不破坏生物组织，能与骨形成牢固的化学结合，已被广泛应用于医用生物材料领域，如硬组织修复材料、药物及基因载体等。

3 nHAP的抗肿瘤作用机制

Sun等［3］采用液相沉淀法合成nHAP微晶作为抗癌药物载体，在体外细胞培养实验中意外发现，nHAP微晶明显抑制Ca-9癌细胞的增殖，而且，他们还发现nHAP微晶体能够吸附阿霉素(ADM)、氟尿嘧啶(5-FU)、丝裂霉素C(MMC)等抗肿瘤药物，作为它们的载体，而ADM和载有ADM的HAP(ADMHAP)对癌细胞均有抑制作用，且后者明显优于前者［4］。多项研究［5～8］已证实，nHAP 能够抑制人白血病、骨肉瘤、恶性黑色素瘤、肝癌等多种癌细胞的增殖。目前，研究发现nHAP抗肿瘤作用的机制可能有以下几个方面。

3．1 nHAP作为化疗药物、基因治疗的载体nHAP颗粒小、无毒、无免疫原性、有良好的组织相容性、生物黏附性强，可吸附药物量大并且能结合、运载大分子药物，可对插入其中的DNA片断有很好的保护作用，是一种良好的药物或基因载体，能够携带抗肿瘤药物或放射性元素杀灭肿瘤细胞。Itokazu等［9］报道，ADM-HAP作用于骨肉瘤细胞效果较好，ADM缓慢释出可显著延长药物作用时间，能更有效地抑制癌细胞增殖。nHAP可将蛋白类药物或DNA、RNA等基因治疗分子包裹或吸附在其表面，同时也可在颗粒表面偶联特异性的靶向分子，比如特异性配体、单克隆抗体等，通过靶向分子与细胞表面的特异性受体结合，经细胞吞饮进入细胞内，实现安全有效的靶向药物治疗或基因治疗［10］。

3．2 nHAP作用于细胞膜 正常状态下细胞内Ca2+维持在低水平，肿瘤细胞比正常细胞有更强的钙摄入能力。nHAP作用于细胞膜，可导致过多的Ca2+摄入，增加细胞内Ca2+浓度，使细胞内钙稳态失衡，激活细胞内的Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶，使 DNA 降解、细胞凋亡［11］。

3．3 nHAP作用于细胞内溶酶体 肿瘤细胞较正常组织细胞有更高的吞噬活性。nHAP溶胶易被吞噬进入细胞，与初级溶酶体结合形成次级溶酶体，在其内降解产生游离酸或者其他细胞毒性产物，导致溶酶体破裂及酶的释放，从而启动溶酶体的凋亡途径，抑制肿瘤生长或直接破坏细胞膜的通透性，导致细胞肿胀、破裂、死亡［12］。

3．4 nHAP影响核酸合成 张建平等［13］采用单细胞凝胶电泳技术，检测nHAP对大鼠乳腺癌细胞系Walker256的 DNA损伤作用，发现 nHAP可导致DNA链形成缺口，阻碍核酸合成，并且作用强度与剂量呈正相关。

3．5 nHAP诱导细胞周期阻滞与凋亡 研究发现，nHAP可能抑制微管、微丝的形成，使癌细胞分化受阻于G2期，并推测，假如nHAP与G2期时相敏感抗癌药合用，会有化疗增敏作用［14］。p53、p21、c-myc等基因和Caspase等是调节细胞凋亡的重要基因，它们控制细胞DNA损伤的应答时序，协调应答过程，通过调节DNA复制、阻断细胞周期或促进细胞凋亡等程序，引起诸多相关基因的转录［15］。p53是一类重要的抑癌基因，主要在G1/S期起控制点作用，它决定细胞是否启动DNA合成。p53蛋白可上调p21(细胞周期依赖的蛋白激酶抑制剂)表达，阻止细胞分裂，并给细胞提供足够的时间来修复损伤。c-myc是另一个使细胞由G1期向S期过渡的必要的早期应答基因。研究发现［7］，nHAP能够上调p53表达，下调c-myc表达，使细胞周期阻滞于G1期。

3．6 nHAP影响端粒酶的活性 端粒酶活性表达是诸多恶性肿瘤获得无限制生长能力中很重要的环节。端粒酶的主要功能是维持染色体末端的端粒序列，维持染色体的稳定性，抵消因细胞分裂所致的端粒DNA损耗，起到抑制肿瘤细胞的作用。nHAP有抑制肿瘤细胞端粒酶基因表达和下调端粒酶活性的作用［16］。

4 nHAP对脑胶质瘤的治疗作用

目前，脑胶质瘤的主要治疗方法是手术切除，辅以放化疗。但是，脑胶质瘤的基因特性决定了其对放射治疗不敏感。而且，血脑屏障(BBB)使绝大多数小分子化合物和几乎所有的大分子物质不能进入脑病变区，也削弱了化疗药物对脑胶质瘤的疗效。

纳米粒子转运药物不需要开放BBB，允许几乎所有的药物被转运入脑细胞内，且不需要对药物本身进行修饰;另外，还可用纳米控释系统使药物缓慢的释放，维持长时间脑血管药物浓度，提高疗效。沈维高等［17］将负载Stat3 shRNA的nHAP作用于鼠胶质瘤C6细胞，发现其显著抑制肿癌生长。因此，推测nHAP有望成为脑胶质瘤基因、化学药物治疗的良好载体。

nHAP 本身具有广谱抗癌作用。田昂等［18，19］应用电化学沉积法在钛合金表面制备nHAP涂层，与人脑胶质母细胞瘤细胞系U87细胞共培养，发现nHAP涂层能够很好地抑制U87细胞的增殖，证实了nHAP对胶质瘤具有抑制作用，并且nHAP的不同形态对U87细胞增殖有不同的抑制作用，其中针状结构抑制作用最强。

研究证实，nHAP只能与TLR+4的单核细胞相互作用。Toll样受体(TLRs)为Ⅰ型跨膜受体，用来识别和传导先天性和适应性的免疫反应信号，通过以核因子-κB(NF-κB)为主的刺激信号的级联反应信号传导通路，激活多种靶基因，导致细胞因子的释放和协同刺激因子的表达。胶质瘤是起源于胶质细胞的神经系统肿瘤，胶质细胞在神经系统中行使单核细胞的功能。胶质瘤细胞本身可以表达TLRs［19］，这为nHAP作用于胶质瘤并通过TLRs进行信号传导提供了理论依据，其机制可能涉及TLR4受体的调控表达［19］。

TLR4是中枢神经系统重要的炎性受体，能够启动细胞内信号转导，通过NF-κB和c-Jun氨基末端激酶(JNK)/应急激活蛋白激酶(SAPK)两条途径激活炎性细胞，导致炎性因子TNF-α、IL-6等的大量表达，触发一系列的炎性反应，可对肿瘤细胞起到抑制作用。Grandjean-Laquerriere等研究发现，nHAP可以诱导 TNF-α、IL-6、IL-10和 IL-18的高表达，上调基质金属蛋白酶(MMPs)、IL-1b的高表达。但nHAP与胶质瘤细胞TLRs的相互作用及信号传导途径还有待进一步研究。

5 nHAP的生物安全性及存在的问题

nHAP具有很好的生物活性和生物相容性，并且能与骨形成紧密的化学结合，作为人工骨材料和组织材料已得到广泛应用。

郭晓东等通过Ames试验、微核试验、急性和亚急性毒性试验、溶血试验和凝血试验，证明nHAP/PDLLA材料没有毒性，无致突变性和刺激性，不会引起溶血和凝血。刘丽萍等给家兔静脉注射nHAP，发现致死剂量或接近致死剂量的nHAP，对动物的肝肾功能及酶的影响是一过性的，各项功能均在很短时间内恢复正常，无明显毒性蓄积。但是，研究发现，nHAP颗粒所组成的溶胶具有一定的不稳定性，随着存放时间的延长及胶体浓度的增加，nHAP颗粒会出现团聚现象，使颗粒体积增大，甚至超出纳米级的范围。当nHAP颗粒超过毛细血管内径范围时，将产生严重后果，如果广泛栓塞肺毛细血管网，导致急性呼吸功能衰竭和右心功能衰竭。

nHAP粒子溶胶的血液相容性研究结果提示，在制备nHAP粒子的时候，应充分考虑粒子的尺寸与分散性可能带来的生物学效应。另外，nHAP可能会从复合材料中游离出来，并在体内迁移，对生物体产生影响;或者某些成分从nHAP中游离出来，导致nHAP的性能改变，对生物体产生影响。

因此，将nHAP用作靶向药物载体和抗肿瘤药物前需要解决以下问题:①nHAP粒子是否容易获得和均匀分散;②在加载药物或蛋白质等处理过程中，nHAP粒子的粒径分布是否能稳定在100 nm范围内;③nHAP粒子不应该对正常人体细胞产生毒性作用。在考虑nHAP的生物学应用前景时，除了要考虑nHAP粒子本身的性质外，筛选具备生物学惰性的稳定剂、分散剂也是不可忽视的问题。

6 展望

nHAP具有特殊的物理、化学性质及生物特性，表现出良好的骨诱导性及骨结合性，可以作为药物载体，在生物医学领域展现出广泛的应用前景。而且，nHAP具有广谱抗癌作用，对多种癌细胞的增殖、生长具有抑制作用，但其抗肿瘤机制尚未研究清楚，特别是信号传导及基因调控等方面。相信随着研究的不断深入，对nHAP性能的了解会越来越多，其安全性得以充分的评价，其用途也将越来越广泛，定会为脑胶质瘤的治疗提供新的途径。

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