淋巴管新生与肿瘤转移的研究进展

邓恋综述 刘陶文审校

转移是肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因。经淋巴道转移是恶性肿瘤转移的重要途径之一，既往的研究由于缺乏淋巴管内皮细胞标志物，很难区分肿瘤组织中的血管和淋巴管［1］。随着淋巴管内皮细胞标志物如 VEGFR-3、LYVE-1、Prox-1、podoplanin以及D2-40等的发现，关于肿瘤淋巴道转移的过程及分子机制的研究成为热点［2，3］。以VEGF-C和VEGF-D为代表的多种促淋巴管生成因子从不同途径诱导肿瘤组织淋巴管新生，促进肿瘤细胞经淋巴道转移。

1 淋巴管内皮标志物

业已证实淋巴管内皮细胞标志物主要有以下几种:①血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factor receptor 3，VEGFR-3)是第1个被鉴定的淋巴管内皮标志物。VEGFR-3在胚胎早期主要参与血管形成，表达于血管和淋巴管内皮细胞。成年后仅见于淋巴管内皮细胞，主要与淋巴管新生和肿瘤淋巴管转移有关。在恶性肿瘤中，VEGFR-3能与VEGF-C、VEGF-D特异性结合，促进肿瘤淋巴管生成。Smith等［4］观察到大肠癌组织中VEGFR-3主要分布于瘤内淋巴管内皮细胞，在血管中未见表达;而乳腺癌组织新生血管内皮中VEGFR-3高表达。因此，关于VEGFR-3作为淋巴管内皮细胞标志物的特异性还存在争议。②淋巴管内皮透明质酸受体-1(lymphaticvessel endothelial HA receptor，LYVE-1)在透明质酸的代谢、结合及其进入淋巴管的过程中起重要作用，同时也参与淋巴结和淋巴管内白细胞的归巢［5］。该分子主要表达于淋巴管内皮细胞及肝、脾的窦状内皮细胞，在巨噬细胞、淋巴结中毛细血管后微静脉(high endothelial venule，HEV，也称之为高内皮小静脉)及胚胎卵黄囊中的血管也有表达，其特异性有待进一步研究。③果蝇prospero同源异形盒蛋白1(Prospero related homeobox gene-1)是早期淋巴系统发育的1个重要分子。Prox-1表达于晶状体、心脏、肝脏、胰腺和神经系统等多种组织的非内皮细胞［6］;在内皮细胞仅特异性地存在于成人正常组织、胚胎或肿瘤组织中的淋巴管内皮细胞，具有较高的特异性和灵敏性。④肾小球足突细胞膜蛋白(Podoplanin)主要表达于小淋巴管，在血管中(包括淋巴结内的高内皮小静脉)无表达［2］，此特性使其在许多研究中作为淋巴管内皮细胞的特异性标志物。⑤D2-40单克隆抗体最初是研究M2A抗原时制备的1种单克隆抗体。之后的研究显示D2-40是1种高度特异性的淋巴管内皮细胞标志物。在正常及肿瘤组织中用D2-40及CD34双重免疫组化技术显示D2-40仅特异性的标志淋巴管内皮而不标志血管内皮［3］。最近，观察到D2-40在人类多种肿瘤中也有表达，如非小细胞肺癌、食管鳞状细胞癌等［7，8］。说明D2-40可能与肿瘤细胞的分化程度及恶性程度有关。

2 促淋巴管生成分子

VEGF-C和 VEGF-D(vascular endothelial growth factor C、D)是目前研究较为广泛的促淋巴管生长因子。VEGF-C、VEGF-D通过与淋巴管内皮细胞表面的受体VEGFR-3特异性结合，激活依赖蛋白激酶C的p42/p44 MAPK信号转导途径，而使淋巴管内皮细胞增生、迁徙和存活，导致促淋巴管生成。VEGF-C、VEGF-D高表达可诱导肿瘤淋巴管新生和促进肿瘤淋巴结转移［9］。Sugiura等［10］报道 VEGF-C 和 VEGF-D 在口腔鳞状细胞癌中的高度表达与肿瘤组织内淋巴管密度、淋巴结转移及患者的不良预后密切有关。在肿瘤发生淋巴结转移过程中VEGF-C的生物学效应强于VEGF-D。在大鼠肿瘤模型中VEGF-C的第二受体neuropilin-2也可以诱导肿瘤相关淋巴管的生成，抑制VEGF-C/D-VEGFR-3或neuropilin-2信号通道，可减少肿瘤发生淋巴结转移或远处器官转移［11］。此外，血管内皮生长因子家族的VEGF-A与其受体VEGFR-2结合也可诱导肿瘤淋巴管生成，但是VEGF-A是直接促进淋巴管的生成还是通过诱导其他相关分子促进淋巴管新生尚不清楚。此外，在小鼠肿瘤模型中观察到促血管生成因子如血小板来源生长因子BB，肝细胞生长因子、血管生成素及胰岛素样生长因子1、2等都可以诱导淋巴管生成［12～15］，而转化生长因子 β 能够显著抑制淋巴管生成［16］。

3 淋巴管生成与肿瘤转移的关系

3.1 淋巴管新生对肿瘤发生淋巴结转移的作用

淋巴结是大部分肿瘤分期的关键因素。某些恶性肿瘤，如黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌，最初是通过淋巴管转移到区域淋巴结。目前通常经全切或部分切除区域淋巴结行病理检查确定是否存在淋巴结转移，然后根据淋巴结转移情况决定治疗策略。但是，由于手术切除的局限性，部分发生跳跃性转移的引流淋巴结可能被漏检，从而导致错误的肿瘤分期及治疗方案。因此，寻找新的方法准确判断肿瘤有无淋巴结转移是目前亟待解决的问题。

既往研究认为肿瘤内不存在淋巴管，随着对淋巴管内皮细胞特异性标志物的鉴别，大量研究发现肿瘤内存在新生的淋巴管。在形态结构上肿瘤新生淋巴管与正常组织的淋巴管相比截然不同，肿瘤组织内新生淋巴管管壁较薄，与细胞间质结合疏松，虽然没有成熟的淋巴管网中丰富的盲端和分支，但肿瘤新生淋巴管内皮细胞疏松的细胞间隙及不完整的基膜仍是肿瘤细胞侵入淋巴管管腔的最佳通道。肿瘤淋巴管新生主要发生在肿瘤组织内及瘤周。瘤周淋巴管(peritumoral lymphatics)常呈扩张状态并弥漫性地分布于肿瘤周围，瘤内淋巴管(intratumoral lymphatics)则由于迅速增长的肿瘤组织挤压而呈塌陷或闭塞状态，瘤内淋巴管是否为功能性淋巴管、是否与肿瘤转移有关尚不十分清楚。

随着对肿瘤淋巴管新生的研究进展，几种新的可评价淋巴管生成的参数已用于临床研究，其中包括肿瘤淋巴管密度、肿瘤淋巴管侵犯及肿瘤引流淋巴结中淋巴液流速及流量的改变。淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)是评估肿瘤淋巴管新生的重要指标。部分研究发现皮肤黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、膀胱移行细胞癌、非小细胞肺癌中肿瘤周围淋巴管与瘤内淋巴管的分布有显著性差异。与瘤内淋巴管密度(intra-tumoral lymphatic vessel density iLVD)相比，瘤周淋巴管密度(peri-tumoral lymphatic vessel density，pLVD)与肿瘤发生淋巴结转移有关。因此，观察肿瘤LVD可以客观判断肿瘤淋巴管生成情况，且有利于评估肿瘤淋巴结转移的风险及预后。Wang等［17］应用D2-40单克隆抗体标记胰腺癌淋巴管，发现胰腺癌pLVD与iLVD无显著性差异。pLVD与胰腺癌细胞的分化程度、淋巴管浸润及淋巴结转移有关，iLVD则与这些参数无关。推测pLVD可作为预测淋巴结转移和评估肿瘤预后的1个重要指标。此外，Ying等［18］应用D2-40单克隆抗体标记宫颈鳞状细胞癌中的淋巴管，发现D2-40阳性标记的淋巴管腔主要位于瘤周区域，这些新生淋巴管呈扩张状态，管腔形状和大小不规则;进一步观察到瘤周淋巴管密度与宫颈癌的复发有关，与盆腔淋巴结转移无关。该研究认为检测瘤周淋巴管密度有助于评估肿瘤复发的风险性。然而，存在淋巴结转移的乳腺癌、宫颈癌及前列腺癌组织内淋巴管密度与肿瘤发生淋巴结转移却没有相关性。上述研究结果的差异，可能与肿瘤的发生部位、组织学类型、微环境产生的淋巴管生成因子等有关。淋巴管新生是否与肿瘤发生淋巴结转移有关有待进一步研究。

3.2 毛细淋巴管的解剖学特点及肿瘤细胞远处转移的途径

转移是恶性肿瘤的重要特征之一，经血道和淋巴道转移是肿瘤转移的2个重要途径。与毛细血管相比，微小淋巴管具有以下特点:①毛细淋巴管的管径比毛细血管大;②淋巴液流速缓慢、剪切力低，其组成与组织间液基本相同，没有血清中各种细胞因子等因素的影响;③毛细淋巴管管壁薄，基膜不完整，内皮细胞间隙大。这些特点有助于肿瘤细胞的存活、增殖，为经淋巴道转移提供了有利条件［19］。

肿瘤细胞在生长的过程中，可通过3条途径向区域淋巴结或远处器官转移。首先，肿瘤细胞可通过直接侵犯周围组织发生转移;其次，肿瘤细胞通过自身运动经微血管进入淋巴管，然后向淋巴结或远处器官转移;此外，肿瘤细胞也可以通过瘤内或瘤周淋巴管进入淋巴循环，转移至前哨淋巴结，然后通过引流淋巴结到达胸导管和右锁骨下静脉，从而到达远处器官。由此可见，血循环和淋巴循环在肿瘤细胞的播散过程中是缺一不可、紧密相连的。

3.3 原发肿瘤诱导的淋巴结淋巴管生成

最初对于淋巴管新生的研究主要集中在肿瘤原发部位及周围组织上。Paget在1889年提出了肿瘤的“种子和土壤”假说，该假说认为肿瘤细胞的转移发生在特定器官的特定环境。最新研究发现“种子”的“土壤”来之不易，在肿瘤细胞发生转移之前，原发肿瘤可能已经在准备“土壤”以营造肿瘤细胞的生存环境。对口腔鳞状细胞癌及非小细胞肺癌的研究发现原发肿瘤可以诱导前哨淋巴结中淋巴管的新生，而且这在肿瘤转移之前就发生了，肿瘤产生的VEGF-C在此过程中起重要作用［20，21］。

3.4 肿瘤细胞对淋巴管的侵犯

肿瘤侵犯淋巴管又称淋巴管侵犯(lymphovascular invasion，LVI)，即肿瘤细胞进入淋巴管管腔，通常表现为1个或1簇癌细胞在肿瘤原发部位或远处转移器官的淋巴管管腔内聚集。淋巴管内皮细胞可分泌趋化因子吸引肿瘤细胞向高淋巴管密度的区域迁徙，肿瘤细胞通过黏附、迁移等过程侵入毛细淋巴管，然后聚集形成瘤栓进入下一级淋巴管或远处淋巴结［22］。大部分学者认为肿瘤组织淋巴管侵犯是造成淋巴结转移的关键步骤。对非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌及黑色素瘤、膀胱移行细胞癌的研究均发现有肿瘤淋巴管侵犯。更重要的是，与血管相比，肿瘤细胞更容易侵犯淋巴管［23～26］。75%的黑色素瘤患者的瘤内及瘤周淋巴管都有癌细胞侵犯，同时伴有前哨淋巴结的转移，LVI是评价肿瘤患者预后及总体生存率的1个重要参数［27］。

4 肿瘤淋巴管新生的分子靶向治疗

4.1 单克隆抗体

应用参与淋巴管生成信号途径分子的单克隆抗体可抑制淋巴管新生的信号传导，从而达到阻滞肿瘤淋巴转移的目的。目前研究较多的是应用抑制VEGFR-3/VEGF-C和VEGFR-3/VEGF-D信号途径的抗体。在动物模型中发现应用VEGFR-3中和抗体可以减少淋巴管的生成，并能在一定程度上阻抑肿瘤经淋巴管的转移，进一步研究发现VEGFR-3中和抗体对新生淋巴管的形成有抑制作用，但是对已经存在的淋巴管没有影响［28］。VEGF-A对肿瘤淋巴管生成也有促进作用，VEGF-C和VEGF-D也可以激活 VEGFR-2，因此联合抑制 VEGFR-2和VEGFR-3或VEGF-A和VEGF-C/D诱导的信号途径与单独抑制以上途径相比，前者在阻滞肿瘤诱导的淋巴管新生方面可能具有更大的潜在价值。

4.2 可溶性受体

可溶性受体VEGFR-3-Ig是由VEGFR-3的胞外区基因及IgC Fc基因偶联组成的，经载体转染肿瘤细胞使其表达VEGFR-3-Ig。可溶性受体VEGFR-3-Ig与膜表面受体VEGFR-3竞争地与VEGF-C/D结合从而抑制信号传导。Yang等［29］在大鼠原位膀胱癌模型中，使用VEGFR-3-Ig抑制VEGF-C/D的信号途径可显著抑制肿瘤淋巴管新生及肿瘤淋巴管转移。

4.3 小分子抑制剂

VEGFR-3和VEGFR-2均具有酪氨酸激酶活性，目前，已在临床上应用的索拉非尼及舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂通过与VEGFR-2和VEGFR-3结合并抑制细胞内的信号转导，从而抑制肿瘤血管的新生。至今尚未见有关索拉非尼及舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂是否具有抗淋巴管生成作用的报道。西地尼布是1种抑制VEGF-A诱导的血管生成的小分子酪氨酸激酶抑制剂，Heckman等［30］研究发现西地尼布不仅可以抑制 VEGFR-2的活性和血管的生成，还具有抑制VEGFR-3的活性和淋巴管生成的作用。SU5416是1种合成的酪氨酸激酶小分子抑制剂，对VEGFR-3的抑制作用大约是对VEGFR-2的5倍，但SU5416是否具有抑制肿瘤淋巴管生成的作用尚不清楚［31］。

4.4 基因治疗

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指由外源性或内源性双链RNA(dsRNA)诱导转录后引起特异性基因沉默(PTGS)。小干扰 RNA(siRNA)和微小 RNA(microRNA，miRNA)是RNAi技术最主要的组成部分，已成为分子生物学研究热点之一，并作为1种新的靶向治疗方法应用于肿瘤的治疗研究。Lui等［32］体外培养大肠癌LOVO细胞并加入小分子RNA以干扰VEGFR-3的表达，结果显示此技术可显著抑制肿瘤细胞增殖和淋巴管新生。

总之，目前大多数研究已显示在肿瘤组织中存在淋巴管新生。淋巴管特异性标志物及促淋巴管生长因子的发现扩展了对肿瘤相关淋巴管生长的分子机制和新生淋巴管的探索。这些研究有益于肿瘤治疗的新策略，如针对肿瘤淋巴管新生的靶向治疗的开发与应用。

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