冻干活疫苗中保护剂的作用及研究

北京天坛生物制品股份有限公司（100024）孙旭东 陈更新

保护剂是冻干活疫苗中不可或缺的一部分。保护剂作用有以下几点：①具有保护病毒及细菌活力、抗原稳定性、耐干燥和冷冻的低分子物质和形成冻干活疫苗耐热性结构的有机高分子物质；②具有高度抗氧化作用的抗氧化剂，能够最大限度地消耗溶液中溶解的氧，减少病毒或细菌与氧的接触，降低病毒或细菌的代谢活力和能量损耗，防止其在冷冻干燥及储运过程中死亡；③根据保护剂中的每一种物质的共融点进行大量反复冻干试验，科学地确定每一种活疫苗的冻干曲线，使病毒或细菌在冻干过程中的失活率降到最低程度，也使冻干活疫苗形成良好的物理性状。

1 冷冻干燥技术介绍

冷冻干燥技术是目前保持微生物、动物组织、细胞及蛋白质等活性物质生物活性的一个有效的、普遍的方法。在一定的真空条件下，制品溶液预先冻结成固体，然后在低温低压条件下，从冻结状态不经过液态而直接升华除去水分的一种干燥方法。此过程即称为冷冻干燥，简称冻干，是冷冻和干燥的结合[1]。

2 冷冻干燥对疫苗的损伤

在真空冷冻干燥过程中，冷冻和干燥不可避免地会造成部分微生物细胞的损伤及死亡，导致蛋白质变性[2]。为提高和保证冻干活疫苗的存活率与生物活性，人们进行了大量的研究，其中包括冻干过程中蛋白质的空间结构变化，各种保护剂对蛋白质的影响。蛋白质的折叠与展开状态的平衡受周围物理环境（例如pH值、温度、溶剂成分、水合水平等）的影响很大。

从二十世纪六、七十年代开始，国外一些学者对冻干蛋白质的变性机理进行研究，当时认为变性主要发生在冷冻过程。从二十世纪八、九十年代至今，普遍认为在冷冻干燥过程中，冷冻和干燥都会引起蛋白质变性[3]。冷冻变性机理是冷冻过程中结晶引起水的状态和结构的变化，是蛋白质变性的主要原因，并且蛋白质变性的程度依赖于冷冻的程度，冷冻温度越低，蛋白质变性越剧烈。在低温下有序的水的结构引起蛋白质分子中疏水键的破坏是导致蛋白质变性的主要原因。蛋白质分子周围分布着多层水分子，在降温过程中，蛋白质分子周围的水分子不断冻结，但只要蛋白质分子表面的单层水分子没有冻结，蛋白质就不会变性，反之亦然。干燥变性机理是干燥过程的变性，主要是发生在二次干燥阶段即移去结合水的阶段。蛋白质在水溶液中是水化的，表面有一层水分子包围，构成一个单层分子，这就是水化层。这层水分子通过氢键和蛋白质相互作用连接。干燥过程要移去一部分水化层的水，破坏蛋白质表面的氢键结构，引起天然结构的变性。

3 保护剂作用机理

冻干活疫苗的整个冻干过程存在着各种各样的应力，通常包括低温应力、冻结应力（包括枝状冰晶的形成、离子强度的增加、pH值的改变、相分离等）、干燥应力（移去蛋白质表面单层水分子）等，这些应力常常是直接或间接导致生物制品不稳定的因素[4]。保护剂可以改变疫苗冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持生物样品原有的各种理化特性和生物活性，同时对产品贮藏期内蛋白质变性起到抑制作用[5]。

4 保护剂介绍

常用在冻干活疫苗中的保护剂种类有：多羟基化合物、糖、蛋白质、聚合物、氨基酸、盐、表面活性剂等。

4.1多羟基化合物 多羟基化合物是保护剂中重要成分之一，常见的有甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、侧金盏花醇等[6]。多羟基化合物的保护机理：由于疫苗蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子连接，当冻干过程中脱水后，多羟基化合物的羟基能替代蛋白质表面的水分子的羟基，与蛋白质表面形成一层假定的水化膜，从而保护氢键的连接位点不直接暴露在周围环境中，稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干而变性。

4.2糖 糖是冻干活疫苗中最常见的保护剂，使用最广的一类必要成分，为蛋白质的非特异性稳定剂。在冻干及保存各阶段均能对生物制品起到一定的保护作用。糖的保护作用与其及蛋白质的种类有关[7]。常见的有蔗糖、乳糖、海藻糖、菊糖、糊精等。糖的保护作用：二糖对阻止蛋白质二级结构的改变、冻干处理过程中及贮藏期内蛋白质多肽链的伸展和聚集起着显著作用。二糖中的蔗糖和海藻糖是研究最多、也是公认最有效的保护剂。

4.3蛋白质 蛋白质保护剂是保护剂的重要组分。蛋白质类保护剂根据来源可分为两种：动物源性蛋白质和外来蛋白质。血清白蛋白是一个经典-优良的蛋白质稳定剂，人血清白蛋白则在更低浓度（＜0.05%～0.1%）时能有效阻止蛋白质表面的吸附，对冻干过程中多数蛋白都具有保护作用。目前，也有报道称重组人白蛋白推荐为血清白蛋白的替代品[8]。

4.4聚合物 聚合物作为大分子物质保护剂，要与小分子物质联合使用，常见的有聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、明胶、聚乙烯亚胺。通常聚合物的稳定作用取决于聚合物的多重性质，如优先从蛋白质表面析出、表面活性、使蛋白质溶液浓度升高从而阻止其他小分子（如糖及多羟基化合物）的结晶、抑制冷冻过程中pH值的剧烈变化等。

4.5氨基酸 氨基酸是蛋白质保护剂常见的一种，常用的氨基酸类保护剂有精氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸等。在冷冻过程中的主要作用是能升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷而引起蛋白质结构的破坏[9]。

5 保护剂的选用

要想获得稳定的活疫苗冻干制品，保护剂的选用至关重要。保护剂的选取对提高其稳定性尤为重要。一个优良的保护剂要对保持疫苗的玻璃化有利，因为玻璃化的疫苗不仅复溶速率高，物理性状好，而且质量稳定性高。要对被保护的疫苗物理化特性有了解，通过试验摸索出在冻干过程及贮藏过程中导致该疫苗不稳定的因素。然后针对这些不稳定性因素选择具体的保护剂。大量实验证明，糖及多羟基化合物是最常用的保护剂。其中蔗糖对一些蛋白质能显示出很好的保护作用，故在选取保护剂时要优先考虑。使用任何一种保护剂不能对活疫苗起到所有的保护，因此还得考虑两种或两种以上的保护剂的使用。在考虑使用多种保护剂时，不同种类的保护剂能起到显著的保护效果。此外，原辅材料的选购、配制、灭菌、保存和使用，对于冻干活疫苗的质量起着至关重要的作用，如在保护剂配制过程中，使用不同厂家生产的原材料进行活疫苗的冻干，结果可导致疫苗在耐老化试验后效力检验达不到质量标准的要求。此外，原辅材料中的杂质也会对冻干活疫苗的稳定性产生影响。保护剂通常有一个最佳的使用浓度，所以需要摸索合理的配比使用量。保护剂的配制对活疫苗的稳定性同样有重要作用。在配制过程中应注意以下几点：①配制用水的标准；②称量的准确度；③保护剂的溶解顺序；④大分子物质与小分子物质混合比例；⑤保护剂贮存温度。以上任何一个环节出现问题，都可能会影响保护剂的性能，导致保护剂失去保护病毒的作用，从而导致活疫苗质量的不稳定。

6 小结

在冻干前，疫苗要经过配液、过滤及分装等过程，期间疫苗处于水溶液这一相对不稳定状态，即使相对较短时间，也可能发生降解反应。因此应加快各操作步骤，尽量缩短该过程持续时间，以防溶质发生沉淀，进而导致疫苗稳定性降低。

保护剂因其独特的生产工艺条件，为许多活疫苗特别是对温度敏感的抗原和水溶液中不稳定的抗原提供了稳定的制备方法，发展十分迅速。但冷冻干燥是一个伴随有热质转换发生的非常复杂的物理化学变化过程，在冻干过程中冷冻浓集引起的高盐浓度、pH值变化和干燥失水引起的表面作用都会对疫苗抗原结构稳定性产生影响。除此以外，对疫苗稳定性有重要影响的因素还有水分含量、保护剂结晶等。

为了提高活疫苗的稳定性，对冻干生产工艺和保护剂选择进行了大量的研究，其中保护剂的选取对提高其稳定性尤为重要。一个优良的保护剂要对保持疫苗的玻璃化有利，因为玻璃化的疫苗不仅复溶速率高，物理性状好，而且质量稳定性高。目前，已掌握了一些保护剂的作用机制，但不同的抗原稳定性不同。仍需要进一步深入研究保护剂机理，最终提供满足不同条件的有效稳定的保护剂，为生产出质量合格稳定的冻干活疫苗提供保障。