法医DNA试剂盒在人员血样检验中应用

刘亚举，张俊涛

法医DNA检验检材主要来源于案件现场和人员生物样本。案件生物样本附有高度可变的载体，DNA浓度低、质量差、类型陈旧、易混合，而人员样本是可预测的高浓度高质量DNA、有标准化载体进行采样、类型新鲜、来源单一。随着DNA检验试剂盒的增多，针对以上不同的样本需要采取不同的应对措施。本文介绍几种DNA试剂盒在人员血样检验中的应用，也是作者的使用体会，以供大家参考。

1 STR荧光复合扩增试剂盒发展历程

1997年11月，FBI确立CODIS系统，包含13个核心基因座(CSF1PO，FGA，TPOX，TH01，vWA，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11)和性别基因座Amelogenin。2000年5月，美国Promega公司研制出了PowerPlex 16试剂盒，增加了2个五核苷酸基因座Penta D和Penta E；2001年7月，美国AB公司开发出了Identifiler试剂盒，增加了2个四核苷酸基因座D2S1338和D19S433。随后荧光复合扩增系统试剂盒被应用于相关的领域，不同的是Identifiler试剂盒系5色荧光标记技术，而PowerPlex 16试剂盒系4色荧光标记技术。2007年之后，国产STR荧光复合扩增系统试剂盒也出现，主要在CODIS系统的基础上，选择Penta D、Penta E、D2S1338、D6S1043，D12S391和D19S433等基因座。

欧洲标准(ESS)推荐的是FGA、TH01、vWA、D3S1358、D8S1179、D18S51、D21S11、D12S391、D1S1656、D2S441、D10S1248、D22S1045和Amelogenin。现在欧洲标准(ESS)增加了D16S539、D2S1338、D19S433和SE33等基因座。最近，美国FBI对CODIS基因座重新进行了评估升级，并最终确立了含20个STR基因座的扩展核心基因座[1-2]。Identifiler试剂盒除TPOX外的15个基因座和D1S1656、D2S441、D10S1248、D12S391、 DYS391基因座，并推荐TPOX、D22S1045和SE33为备选基因座。

2 不同试剂盒在人员血样检验中应用

2.1Identifiler系列(美国AB公司) 这是一款经久不衰的检验试剂盒，在系列试剂盒中使用相同的引物序列，革新技术亮点是引入非核苷酸连接物修正迁移率，这样可以使不同基因座的两个相距很近的产物片段的位置相对移动，从而防止片段重叠。Stutter产物、非模板添加、杂峰和伪峰等都不明显，峰型尖锐清晰、平衡性好[3]。尤其是现在的GlobalFiler试剂盒，不仅涵盖了新CODIS系统基因座及所推荐基因座，还增加了Y indel基因座，并且采用6色荧光标记技术，使得10个Mini STR基因座在220 bp以下，40 min即可完成PCR扩增。作者在使用GlobalFiler进行直接扩增时，不管是晾干的新鲜或是陈旧纸质血样，1.2 mm圆孔血样均能成功，峰值范围为2 000～8 000 RFU，杂合子两个峰高比例>70%，同一荧光基因座峰高比例>50%；3500 XL电泳时，内标(LIZ500或LIZ600)和甲酰胺是1∶50左右。

2.2PowerPlex系列(美国Promega公司) 它是老牌的STR试剂代表者，革新技术亮点是首先引入五核苷酸基因座Penta D和Penta E，但在系列试剂盒不同版本中相同的基因座要改变引物序列，才能防止片段重叠。另外，在PowerPlex 16HS试剂盒中，克服PCR抑制剂如血红素、腐殖酸和单宁酸等方面表现了卓越性能，将扩增酶混合在Master Mix中，实现了对检材的直接扩增，开创了直接扩增的先河[3]。目前的代表试剂盒是PowerPlex Fusion，其基因座与GlobalFiler试剂盒略有不同，将 Penta D、Penta E代替了SE33和Y indel基因座，PCR扩增时间约60 min。在该系列直接扩增试剂盒中，需要将晾干的新鲜纸质血样水洗或陈旧化处理(如扩增仪95℃、5 min)，作者使用PowerPlex 21试剂盒进行直接扩增时，1.2 mm圆孔血样峰值范围为400～3 000 RFU、杂合子两个峰高比例>70%，同一荧光基因座峰高比例>50%；3130 XL电泳时，内标(ILS500)和甲酰胺是1∶15～20左右。

2.3Investigator系列(德国Qiagen公司) 主要面向欧洲市场，因此按照ESS标准选择基因座，其中Investigator ESSplex SE Plus Kit满足ESS的17个基因座。国内实验室主要应用Investigator HDplex和Argus X-12试剂盒进行亲子鉴定的补充检验[4-6]。在HDplex试剂盒中，需要注意的是基因座D10S2325和SE33的等位基因检测范围非常接近，D10S2325检测到等位基因20和20.1，会出现在SE33的等位基因检测范围，因此对于出现在这2个基因座等位基因检测范围内的可识别的峰型需要仔细判读[4]。作者没有采用直接扩增，而是按照试剂盒说明书进行DNA提取[6]；3130 XL电泳时，内标(BTO-550)和甲酰胺是1∶20左右。

2.4DNATyper15系列(公安部物证鉴定中心) 它是国产试剂盒的杰出代表[7]，前期不包含CODIS系统的TPOX、TH01，增加了Penta E、D2S1338和D6S1043共15个基因座，后期的DNATyper15 Plus试剂盒，又包含TPOX、TH01、D12S391和D19S433等4个基因座。无论是晾干的新鲜或是陈旧纸质血样(FTA卡需水洗一遍)[8]。作者进行直接扩增时，1.2 mm圆孔血样得到的STR分型峰形尖锐清晰且平衡性好；3500 XL电泳时，内标和甲酰胺是1∶20左右。

2.5AGCU系列(无锡中德美联生物技术有限公司) 该系列试剂盒涵盖范围广泛，既有常规染色体又有性染色体(X、Y-STR)基因座，其中AGCU21+1和X-12试剂盒也是进行亲子鉴定的补充检验，另外就是AGCU Ex22(在DNATyper15 Plus试剂盒上增加了Penta D、D2S441和D10S1248)，添加DYS391基因座就变为Ex23试剂盒[9]。作者进行直接扩增时，将晾干的新鲜纸质血样水洗或陈旧化处理(如扩增仪95℃、5 min)，1.2 mm圆孔血样就能成功，峰值范围为400～7 000 RFU，杂合子两个峰高比例>70%，但发现有Stutter产物、检测基线跳跃现象；3130 XL电泳时，内标(SIZ500)和甲酰胺是1∶25～30左右。。

2.6STRtyper系列(珠海科登生物工程有限公司) 原先的STRtyper-10G/F试剂盒经常被应用在亲子鉴定中[10]，为了适应需求，研制出了STRtyper-21G，含有DNATyper15 Plus试剂盒的19个基因座和D1S1656、Penta D基因座。无论是晾干的新鲜或是陈旧纸质血样都可以进行直接扩增。作者在使用过程中，FTA卡需要采用0.5 mm，其它应采用1.2 mm圆孔，得到的STR分型峰形尖锐清晰且平衡性好，但有Stutter产物、检测基线跳跃现象；3130 XL电泳时，可以借用AB的G5，内标LIZ500和甲酰胺是1∶50左右。

2.7Goldeneye系列(北京基点认知技术有限公司) 在国产STR试剂盒中最先采用直接扩增技术，经典代表为Goldeneye20A，在DNATyper15 Plus试剂盒基因座上添加了Penta D。在进行直接扩增时，需将晾干的新鲜纸质血样水洗或陈旧化处理(如扩增仪95℃、5 min)、FTA卡需水洗一遍，1.2 mm圆孔血样均能成功，峰值范围为800～8 000 RFU，杂合子两个峰高比例>70%[11]，但有Stutter产物、检测基线跳跃现象；3130 XL电泳时，内标(Orange500)和甲酰胺是1∶10～15左右。

3 总结

随着技术的发展，法医DNA检验试剂盒主要解决以下问题：①STR基因座数量和遗传多态性：基因座的数目应该满足系统效能，而且应相互独立；遗传多态性要满足DP>0.9、H>0.7[12]，以及低stutter产物、低突变率。在不同的种族、地区和人群中，STR基因座频率具有明显的差异，因此不同的STR基因座往往被选择性地使用。但是，在DNA数据库中进行亲缘关系比对时，会发现Identifiler与PowerPlex 16试剂盒的13个基因座符合亲缘关系，双方实验室使用PowerPlex 16试剂盒进行复核检验后，反而排除亲缘关系。也就是说Penta D、Penta E基因座在中国人群中具有很高的个体识别力和非父排除率。按照目前国内有关学者的建议[13]，Penta D和Penta E基因座应纳入核心基因座。关于SE33基因座具有高度多态性，其内部序列结构相当复杂[14]，具体情况还需进一步使用观察。②样本的检出成功率：首先是抑制因素，如血红素等，主要体现在STR扩增过程酶的活性等。其次是电泳检测时内标的特性和浓度等。第三是检验总时间，主要是扩增时间的缩短改变。

参考文献：

[1]Bulter JM,Hill CR.Biology and genetics of new autosomal STR loci useful for forensic DNA analysis[J]. Forensic Sci Rev，2012,24(1):16-26.

[2]Hares DR.Expanding the CODIS core loci in the United States[J]. Forensic Sci Int Genet, 2012, 6(1): 52-54.

[3]巴华杰，林子清，刘亚楠，等.5种免提取试剂盒检验滤纸血痕结果的比较[J].中国法医学杂志，2013,28(1)：49-51.

[4]张素华，张喆人，孙宽，等.Investigator HDplex试剂盒在华东汉族人群中的法医学应用价值[J].法医学杂志，2012,28(5)：351-354.

[5]张素华，朱如心，李莉，等.Investigator Argus X-12试剂盒在华东汉族人群中的法医学应用评估[J].法医学杂志，2011,27(5)：365-368.

[6]刘亚举，苏伟民，岳俊涛，等.河南汉族人群12个X-STR基因座的遗传多态性[J].法医学杂志，2013,29(4)：297-299.

[7]赵兴春，姜成涛，叶健，等.DNATyperTM15试剂盒的法医学应用研究[J].中国法医学杂志，2008,23(3)：169-171.

[8]张建，姜成涛，赵兴春，等.DNA TyperTM15试剂盒直接扩增检验纸质样本的研究[J].刑事技术，2011(4)：33-35.

[9]唐建新,李双琳,刘宏,等.23个STR基因座荧光复合扩增体系的法医学应用评估[J].中国司法鉴定，2013(1)：98-101.

[10]杨荣芝，梅焜，马丽莉，等.STR-typer 10G/F试剂在单亲鉴定中的应用[J].中国法医学杂志，2013,28(1)：11-14.

[11]刘亚举，史绍杏，魏鹏飞，等. GoldeneyeTM16C系统在批量血样DNA检验中的应用[J].法医学杂志，2013,29(1)：55-56.

[12]Gill P. A new method of STR interpretation using inferential logic development of a criminal intelligence database[J].Int J Leg Med,1996,109(1):14-22.

[13]伍新尧.高级法医学[M].2版..郑州：郑州大学出版社,2011：426-427.

[14]Hering S,Edelmann J,Dressler J.Sequence variations in the primer binding regions of the highly polymorphic STR system SE33[J].Int J Legal Med,2002,116(6):365-367.