葛根素抑制痴呆大鼠模型海马神经元凋亡的研究

王文胜，王英杰，宋纯彦，王连芹，王建民，胡沛霖

（1.河北省邢台市人民医院神经内一科，河北邢台054000；2.河北省邯郸市第一医院神经内三科，河北邯郸056000）

·论 著·

葛根素抑制痴呆大鼠模型海马神经元凋亡的研究

王文胜1，王英杰2，宋纯彦1，王连芹1，王建民1，胡沛霖1

（1.河北省邢台市人民医院神经内一科，河北邢台054000；2.河北省邯郸市第一医院神经内三科，河北邯郸056000）

目的 用痴呆大鼠模型研究海马神经元凋亡机制及葛根素对其干预效应。方法雄性Wistar大鼠36只被随机分为对照组、痴呆组、治疗组，用HE染色、TUNEL染色和流式细胞技术观察痴呆大鼠模型海马神经元的凋亡现象及葛根素的影响，采用免疫组织化学染色和Western Blot分析，研究其分子机制是否涉及凋亡基因Bax、Bcl-2和凋亡蛋白酶caspase-3表达变化。结果①HE染色、TUNEL染色时，对照组海马凋亡神经元少见；流式细胞术测定大鼠海马凋亡细胞率显示，对照组大鼠海马的凋亡细胞率处于较低水平，痴呆组与对照组比较海马凋亡神经元数量明显增加，凋亡细胞率明显增加（P＜0.05），治疗组与痴呆组比较海马凋亡神经元数量明显减少，凋亡细胞率明显降低（P＜0.05）。②痴呆组比对照组大鼠海马组织Bax、caspase-3蛋白的表达量明显增加（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达量明显减少（P＜0.05）；治疗组与痴呆组相比大鼠海马组织Bax、caspase-3的表达量明显降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达量明显增加（P＜0.05）。结论葛根素能抑制痴呆大鼠模型海马神经元凋亡，可为葛根素治疗痴呆提供理论依据。

阿尔茨海默病；葛根素；大鼠

正常人脑内几乎没有或很少有细胞凋亡，而阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）患者脑内，尤其海马区神经细胞凋亡明显增加，神经细胞凋亡过盛可能是AD神经退行性变、神经元丢失的一个重要原因［1］。Bcl-2基因家族是很重要的神经细胞凋亡调控基因。其中促凋亡基因Bax、抗凋亡基因包括Bcl-2起着关键的作用。神经元凋亡的执行主要是通过不同途径最终激活凋亡蛋白酶caspase-3导致神经元凋亡［2］。近年来，在中国、韩国和日本一些天然草药提取物已经被成功地用于防治神经元变性［3］。实际上，人们期望使用无毒有效的天然药物而不是化学药品治疗疾病。葛根素（puerarin）是从豆科葛属植物野葛的干燥根中提取的一种黄酮甙类（flavonol glycoside）天然药物单体，化学名为8-β-D-葡萄吡喃糖-4'，7二羟基异黄酮。作为一种主要的黄酮甙类药物，葛根素易得到、纯度高、稳定性好。本研究探讨葛根素抑制痴呆大鼠模型海马神经元凋亡的机制，旨在为痴呆患者提供一天然有效的治疗药物。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器：葛根素（生产批号110101）购于浙江康恩贝制药股份有限公司，β-淀粉样蛋白25～35片段（β-amyloid protein 25～35，Aβ25～35）购于美国Sigma公司，免疫组织化学染色SP系列试剂盒、二氨基联苯胺显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，聚偏氟乙烯膜（美国）购于Millipore公司，兔抗人Bax多克隆抗体、羊抗大鼠Bcl-2多克隆抗体、兔抗人caspase多克隆抗体、鼠抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG二抗、HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗、发光试剂购于美国Santa Cruz公司。Epics-XLⅡ型流式细胞仪购于美国Beckman Coulter公司，SR-6N型立体定向仪购于NARISHIGE SCIENTIFIC公司，307-6台式牙钻车购于上海医用分析仪器厂，半干转膜仪购于美国BIO-RAD公司，Fluor Chem.HD2型化学发光仪购于美国Alpha Innotech公司，Bio ID数码成像分析系统购于Vilber Lourmat公司。

1.2 实验动物与分组：本研究所用雄性Wistar大鼠36只，体质量（349.0±11.2）g，由河北省实验动物中心提供。涉及动物的实验均得到政府的动物研究委员会批准。36只Wistar大鼠随机分为对照组、痴呆组、治疗组，每组12只。

1.3 方法

1.3.1 制作痴呆动物模型：参照大鼠脑立体定位图谱［4］，在顶骨上钻2个小孔。治疗组和痴呆组用微量注射器向海马CA1区内缓慢注射Aβ25～35，双侧海马各1μL（10μg），每侧海马的注射时间超过20min，留针5min，2次注射间隔10min。对照组行假手术，经所有手术步骤，只是用生理盐水替换Aβ25～35，即用微量注射器用同样的时间，双侧海马注射等量的生理盐水。

1.3.2 葛根素给药方法：治疗组给予葛根素腹腔注射治疗，相应的痴呆组和对照组给予等量的生理盐水腹腔注射行假治疗。治疗组葛根素的用量为150mg/kg。葛根素或生理盐水治疗，1次/d，持续至术后21d。

1.3.3 标本的准备：每组取4只大鼠在葛根素腹腔注射治疗21d后断头处死。迅速剥离出海马，立即放入70％乙醇中固定，用于流式细胞术检测凋亡率。每组再取4只大鼠用于制作石蜡切片。每组的另4只大鼠剥离海马，提取总蛋白，用于Wester Blot分析。

1.3.4 流式细胞术：将固定的组织制成单细胞悬液，加入10％鸡红细胞作为内参标准，激发光源为15mW氩离子激光器，激发波长为488nm，应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析，用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析。

1.3.5 Western Blot分析［5］：各组取等量蛋白提取液经电泳、转膜、一抗、二抗结合后放入化学发光仪内发光。采用数码成像分析系统Western Blot区带进行定量分析，扫描灰度值用积分光密度（integral optical density，IOD）表示。

1.3.6 苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色：石蜡切片经二甲苯液浸泡，梯度乙醇脱水，蒸馏水洗涤，苏木素染色，伊红染色，再分化、脱水、透明、树胶封片。

1.3.7 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）染色：切片脱蜡至水，经蛋白酶K消化，PBS洗，加TUNEL反应液，加显色液，核固红复染，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3.8 免疫组织化学染色：石蜡切片经烘烤，二甲苯浸泡，乙醇梯度脱水，水洗，过氧化氢溶液孵育，抗原热修复，山羊血清封闭，特异性抗体反应，相应二抗反应，DAB显色，苏木精复染，酒精脱水，透明，树脂封片。

1.4 统计学方法：应用SPSS13.0软件进行统计分析，数据经正态性检验和方差齐性检验后，计量资料以±s表示，分别采用F检验和q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 凋亡现象：HE染色的大鼠海马冠状切片上不仅能观察到炎性反应，也可观察到神经元凋亡现象（图1）。大鼠海马锥体细胞带上可见到神经元凋亡，表现为细胞体积缩小，呈多角形、三角形、长条形或纺锤形，胞核与胞浆均浓缩深染，或散在或聚集成团，以CA1区和CA3区多见。对照组神经元凋亡少见，散在，痴呆组多见，常聚集成团，有的完全占据海马锥体细胞带的一段。治疗组介于二者之间。TUNEL染色时上述形态的神经元大部分呈TUNEL染色阳性，证实为神经元凋亡（图2）。对每只大鼠海马CA1和CA3区各一个高倍镜下TUNEL阳性的神经元进行细胞计数，取CA1和CA3区数目和，重复3次，取平均值。对照组TUNEL染色阳性的神经元少见，痴呆组与对照组比较TUNEL染色阳性的神经元数量明显增加（P＜0.05），治疗组与痴呆组比较TUNEL染色阳性的神经元数量明显减少（P＜0.05）。

2.2 细胞凋亡率：流式细胞术测定大鼠海马细胞凋亡率，对照组大鼠海马的凋亡细胞率处于较低水平，痴呆组较对照组凋亡细胞率明显增加（P＜0.05），治疗组较痴呆组凋亡细胞率明显降低（P＜0.05）。

2.3 促凋亡基因表达：免疫组织化学染色可以显现Bax蛋白在海马神经元的表达定位及分布。Bax蛋白位于胞浆或细胞骨架上，Bax蛋白免疫组织化学染色阳性颗粒定位于神经元胞浆。对照组大鼠海马Bax蛋白免疫反应阳性的神经元少见，痴呆组与对照组比较Bax免疫反应阳性的神经元明显增加，着色更深，治疗组与痴呆组比较Bax免疫反应阳性的神经元明显减少，着色变浅（图3）。采用Western Blot对大鼠海马组织Bax的表达量进行定量分析，痴呆组比对照组大鼠海马组织Bax的表达量明显增加（P＜0.05），治疗组与痴呆组相比大鼠海马组织Bax的表达量明显降低（P＜0.05）。

2.4 抑凋亡基因的表达：对照组免疫组织化学染色显示出Bcl-2蛋白在大鼠海马组织有一定的基础表达量，免疫反应阳性颗粒定位于胞浆。痴呆组Bcl-2免疫组织化学染色阳性的神经元比对照组明显减少，着色浅；治疗组与痴呆组比较Bcl-2的免疫反应阳性的神经元明显增加，与对照组接近（图4）。Western Blot分析结果显示，痴呆组大鼠海马组织Bcl-2蛋白表达量较对照组明显减少（P＜0.05），治疗组大鼠海马组织Bcl-2蛋白表达量较痴呆组明显增加（P＜0.05）。

2.5 凋亡相关酶caspase-3蛋白的表达：免疫组织化学染色显示，caspase-3蛋白在神经元胞浆表达，对照组caspase-3免疫反应阳性神经元少见且着色浅，痴呆组caspase-3免疫反应阳性神经元多且着色深，治疗组介于二者之间（图5）。Western Blot分析显示，对照组大鼠海马组织caspase-3蛋白表达量低，痴呆组比对照组海马组织caspase-3蛋白表达量明显增加（P＜0.05），而治疗组比痴呆组caspase-3蛋白表达量明显减少（P＜0.05）。

3 讨 论

神经元凋亡普遍存在于各种脑神经系统疾病的病理过程中。神经元凋亡是AD发病进展过程中的重要事件，是神经元减少、认知记忆功能减退的主要原因之一［1］。AD患者脑组织内的神经元凋亡主要见于海马结构，以CA1区最多，其次是CA3区、下脚区和海马旁回等部位，而正常人这些部位几乎见不到神经元凋亡。Aβ是AD病理改变形成的主要病因。Aβ对神经元具有很强烈的毒性。Aβ刺激神经元可出现胞浆水肿，细胞器肿胀、染色质浓缩、断裂等细胞凋亡的征象［1］。Aβ对神经元有直接导致凋亡的作用，也可能通过促进自由基的形成、破坏细胞内的钙离子稳态，降低K+通道的功能，增强活性分子的介导作用诱导神经元凋亡。

Aβ诱导的炎性反应是Aβ诱导的类AD的病理改变和大鼠认知障碍的重要机制。本研究发现凋亡也是神经元减少的重要机制。一般认为Aβ诱导凋亡不如Aβ诱导的炎性反应更明显。我们认为关于神经元凋亡与炎性坏死在AD患者发病进展过程

中哪种更主要？这个问题目前还没有确定的答案。炎性坏死与凋亡是AD中同时存在的2种神经元死亡形式。在AD中受到致病因素毒性作用强烈破坏的神经元，就发生了炎性坏死，致病因素毒性作用弱，或因未直接作用受损伤轻的神经元，部分被修复，部分发生凋亡。AD是一种慢性进展性的疾病，总体上来说，致病因素的直接毒性作用不会太强，因此凋亡有可能起更主要的作用。本研究中，TUNEL染色和流式细胞术均提示葛根素具有拮抗Aβ诱导神经元凋亡的作用。我们以前的研究发现葛根素对转录因子核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的抑制作用。NF-κB不仅调控多种炎性因子的表达，也调控多种凋亡相关基因［6］。我们认为，神经炎性坏死与神经元凋亡有区别，又是相伴存在的，葛根素的抗凋亡作用可能与葛根素对NF-κB的抑制作用有一定的关系。

目前认为，细胞凋亡的实现主要通过3种途径，线粒体途径、细胞膜途径和内质网途径。3种途径均最终激活caspase-3发生神经元凋亡。Aβ可引起培养的海马神经元凋亡和caspase-3的激活［7］。本研究发现Aβ25～35海马注射可诱导的大鼠海马组织caspase-3的表达增加，意味着大鼠海马细胞凋亡过程的增加，免疫组织化学染色显示神经元内caspase-3的表达增加，提示依赖caspase-3的神经元凋亡途径的激活。可以认为这可能是Aβ25～35海马注射诱导的大鼠海马神经元凋亡增加的分子机制。细胞凋亡的调控是由多种基因参与且非常复杂的过程。Bcl-2基因家族在其中起着主要的作用。Bcl-2在脑组织的神经元中表达较高，神经元依赖Bcl-2的抗凋亡保护作用。AD时Bcl-2在脑组织的神经元中表达被抑制，其神经保护作用减弱。Bax促进caspase-3活化，从而促进细胞凋亡。本研究发现Aβ25～35海马注射诱导大鼠海马组织Bax蛋白表达增加，Bcl-2表达减少，提示Aβ通过诱导Bcl-2和Bax的表达变化，增加海马神经元凋亡。

药物可以通过促进Bcl-2表达、抑制Bax表达减少神经元凋亡［8］。葛根素是黄酮甙类中药有效单体。本研究发现葛根素抑制Aβ25～35诱导的大鼠海马组织促凋亡蛋白Bax的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，且抑制凋亡相关酶caspase-3的表达，这可能是葛根素抑制神经元凋亡的分子机制。AD作为一种慢性进展性的老年相关性疾病，最需要可长期应用的有效的纯天然药品治疗。本研究证明葛根素可能就是这样的药物。（本文图见封三）

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（本文编辑：赵丽洁）

PUERARIN INHIBITION ON H IPPOCAMPAL NEURONAL APOPTOSIS IN DEMENTIA RAT MODEL

WANGWensheng1，WANG Yingjie2，SONG Chunyan1，WANG Lianqin1，WANG Jianmin1，HU Peilin1
（1.Department of Neurology，the People's Hospital of Xingtai City，Hebei Province，Xingtai054001，China；
2.Department of Neurology，the First Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056000，China）

ObjectiveTo investigate hippocampal neuronal apoptosismechanisms and effect of puerarin's intervention in dementia rat model.MethodsThirty-six male Wistar rats were randomly divided into control group，dementia group，treatment group.HE staining，TUNEL staining and flow cytometry were used to observe the hippocampal neuronal apoptosis and effect of puerarin in dementia rat model，immunohistochemical staining and Western Blot analysis were performed to study the molecular mechanisms involved in apoptosis genes Bax，Bcl-2 and apoptotic protease caspase-3 expression.Results①In HE staining and TUNEL staining，apoptotic neurons in the hippocampus were rare in control group.Apoptotic cell rate of the hippocampus was measured by flow cytometry.The apoptotic rate in control group was ata low level.The number and the rate of apoptotic neuronswere significantly increased in dementia group compared with those in control group（P＜0.05），while the number and the rate of apoptotic neurons in treatment group decreased significantly compared with those in dementia group（P＜0.05）.②Hippocampal tissue Bax and caspase-3 protein expression were significantly increased（P＜0.05），Bcl-2 protein expression was significantly reduced（P＜0.05）in dementia group compared with control group.In treatment group，hippocampal tissue Bax and caspase-3 protein expression were

Alzheimer disease；puerarin；rats

R742

A

1007-3205（2013）07-0753-04

2012-11-08；

2012-12-13

王文胜（1970-），男，河北南宫人，河北省邢台市人民医院副主任医师，医学博士，从事脑血管病介入治疗及痴呆机制研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.07.004

significantly reduced（P＜0.05），Bcl-2 protein expression was significantly increased（P＜0.05）compared with those in dementia group.Conclusion Puerarin can inhibit hippocampal neuronal apoptosis in dementia rat model and it provide a theoretical basis for puerarin in the treatment of dementia.