楚雄川滇金丝桃总黄酮含量的测定*

陆学明，李雪玲，安 洋，王振吉

(楚雄师范学院化学与生命科学系，云南 楚雄 675000)

川滇金丝桃 (Hypericum forrestii N.Robson)，灌木，属于藤黄科 (Guttiferae)，金丝桃属 (Hypericum)，在国内主要分布于产四川西部 (天全、康定)，云南西部，西北部，在中部地区的昆明、楚雄一带也有分布，一般生长于海拔1500—3800米，资源丰富［1］。

川滇金丝桃是一种常见的药用植物［2］。可用于治疗咯血，吐血，肠风下血，外伤出血，风湿骨痛，口鼻生疮，肿毒，烫火伤。近年来研究发现，该属植物中金丝桃素类、口山酮类、黄酮类等成分是其抗抑郁、抗肿瘤、抗病毒、镇痛、抗菌、抗炎等的活性成分，具有重要的开发前景［3］。金丝桃中的二蒽酮类化合物金丝桃素是抗抑郁的主要有效成分之一［4—5］。金丝桃苷是金丝桃属植物的特征性成分之一，具有较强的镇痛，保护脑缺血损伤，保护心肌缺血再灌损伤等作用［6］。金丝桃属的贯叶连翘提取物有抗抑郁、抗病毒作用，作为药物已在德国、英国等国家上市，主要用于治疗抑郁症、甲型和乙型肝炎及艾滋病等［7］。所以对金丝桃内总黄酮含量的研究具有较大的意义。

目前国内外对金丝桃科植物黄酮的研究，主要有贯叶金丝桃［8—12］，长柱金丝桃［13］，近无柄金丝桃［14］，腺点金丝桃［15］，短柱金丝桃［16］和尖萼金丝桃［17］的黄酮类化合物含量及分析等方面的研究，结果表明，不同种类的金丝桃科植物黄酮类物质的含量和组成都有一定差异［8—17］。在贯叶金丝桃的黄酮类化合物研究中，对不同地域生长的贯叶金丝桃的总黄酮含量测定结果表明，总黄酮含量可从2.17%到7.24%变化［11］，因此金丝桃科植物生长环境不同黄酮含量相差也较大。目前，对川滇金丝桃的研究较少，通过本研究可初步明确楚雄分布的川滇金丝桃中总黄酮含量。

对黄酮类化合物的提取方法主要有浸提法，回流法，微波提取法和超声波提取法。根据相关报道，微波提取法在4种方法中得率最低，浸提法，超声提取和回流法较高，但三者没有显著性差异［18］，本实验选用乙醇浸提法，并对此方法进行多因素研究，以提高提取效率，找到最佳的提取工艺。

目前利用金丝桃开发的制剂品种还为数较少，剂型单一，主要集中在金丝桃素，金丝桃苷等药物制剂，限制了其临床应用，因此金丝桃属植物还有待于进一步开发。在云南楚雄分布有丰富的川滇金丝桃资源，分布广，原料易得，四季可采。如何充分、合理开发川滇金丝桃资源，为其临床应用提供充分的药学、药理学依据，还有待系统地进行研究。本研究对楚雄地区川滇金丝桃的开发和利用具有一定意义。

1 实验材料

1.1 实验材料

川滇金丝桃植株 (采自云南省楚雄市紫溪山)

1.2 实验试剂 (药品)

无水乙醇、芦丁标准品、氢氧化钠、锌粉、亚硝酸钠、硫酸亚铁、硝酸铝、氨水、三氯化铁、盐酸。以上试剂皆为分析纯。

2 实验方法

2.1 原料处理

采集的楚雄川滇金丝桃样品混合后，茎叶洗净→阴干→粉碎→备用

2.2 黄酮类化合物的提取

准确称取一定质量的川滇金丝桃茎叶粉末，用一定浓度的乙醇溶液于某温度下水浴浸提一定时间，提取液浓缩后，将提取液以一定浓度的乙醇溶液于50mL容量瓶中定容，得总黄酮提取液。平行实验三次。

2.3 总黄酮的定量分析

2.3.1 标准曲线的绘制

取一定量的芦丁在120℃的恒温干燥箱中干燥1.5h至恒重，然后准确称取芦丁0.0100g，加70%乙醇溶液溶解后，定容到50mL容量瓶中，摇匀，即得0.2mg/mL的芦丁标准液。

亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠，在碱性条件下可使总黄酮与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰，吸光度值与黄酮浓度服从朗伯—比尔定律。准确吸取1.00mL芦丁标准液于25mL比色管中，加入5%亚硝酸钠溶液0.80mL，摇匀，放置6min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL，摇匀，放置6min;加入4%氢氧化钠溶液5.00mL，再用70%乙醇溶液定容至25mL刻度线，摇匀，放置10min，以试剂空白作参比，在440—540nm之间测定提取液的吸光度，确定测定波长。

准确吸取0.2mg/mL的芦丁标准液0.50mL， 1.00mL， 1.50mL， 2.00mL，2.50mL，3.00mL分别置于25mL比色管中，各加入5%亚硝酸钠溶液0.80mL，摇匀，放置6min;加10%硝酸铝溶液0.80mL，摇匀，放置6min;加4%氢氧化钠溶液5.00mL，用70%乙醇溶液定容至25mL刻度线，摇匀，放置10min后。以试剂空白为参比在最大吸收波长下测定吸光度，并绘制标准曲线。

2.3.2 川滇金丝桃总黄酮提取

准确吸取川滇金丝桃总黄酮提取液0.20mL于25mL比色管中，加入5%亚硝酸钠溶液0.80mL，摇匀，放置6min;加10%硝酸铝溶液0.80mL，摇匀，放置6min;加4%氢氧化钠溶液5.00mL，用70%乙醇溶液定容至10mL刻度线，摇匀，放置10min，在500nm波长处以试剂空白为参比测吸光度。

2.4 提取条件的单因素实验

2.4.1 乙醇浓度对提取效果的影响

按2.2所述的实验方法，分别用60%、65%、70%、75%、80%的乙醇为提取剂提取黄酮，并制得样品液，取样品液0.20mL按1.2.4.6所示方法显色后在500nm波长处测定其吸光度，平行实验三次，计算提取液中总黄酮的含量，取其平均值;选择较适宜的乙醇浓度。

2.4.2 浸提时间对提取效果的影响

按2.2所述的实验方法，分别浸提提取0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h，按上述方法显色后在500nm波长处测定其吸光度，平行实验三次，计算提取液中总黄酮的含量，取其平均值;选择较适宜的浸提时间。

2.4.3 浸提温度对提取效果的影响

按2.2所述的实验方法，分别设定温度为65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，按上述方法制得样品液，显色后在500nm波长处测定其吸光度，平行实验三次，计算提取液中总黄酮的含量，取其平均值;选择较适宜的浸提温度。

2.4.4 液料比对提取效果的影响

按2.2所述的实验方法，分别用液料比(mL/g)为:15:1、20:1、25:1、30:1、35:1，同样按上述方法制得样品液，显色后在500nm波长处测定其吸光度，平行实验三次，计算提取液中总黄酮的提取率，取其平均值，选择较适宜的液料比。

3 结果与分析

3.1 黄酮定性检验结果

按实验2.3.1的操作，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制波长在440～540nm范围内的芦丁标准溶液的吸光度与波长关系图，结果表明，芦丁标准溶液在500nm处有最大吸收峰，故选择500nm为最大吸收波长。

总黄酮标准曲线的回归方程为:A=11.306C－0.0063，r=0.9997，表明芦丁在0.01～0.07mg/mL范围内线性关系良好。

3.2 提取条件的单因素实验结果

3.2.1 乙醇浓度对提取效果的影响

按2.4.1操作，采用不同浓度的乙醇溶液浸提楚雄地区川滇金丝桃茎叶中的总黄酮，结果表明，黄酮的提取率随乙醇浓度的增大而增高，当乙醇浓度70%时达到最大值，此后随着乙醇浓度的升高，黄酮的提取率有所下降，说明从楚雄地区川滇金丝桃茎叶中提取总黄酮时，采用70%的乙醇溶液为提取剂可获得较好效果。

3.2.2 浸提时间对提取效果的影响

按2.4.2操作，改变浸提时间提取楚雄地区川滇金丝桃茎叶中的总黄酮，结果表明，浸提时间在2.0 h时黄酮的提取率达到最大值，浸提时间高于2.0 h以后，黄酮的提取率有下降的趋势，因此从楚雄地区川滇金丝桃茎叶中提取总黄酮时，浸提的最佳时间确定为2.0h可获得较好效果。

3.2.3 浸提温度对提取效果的影响

按2.4.3操作，改变浸提温度提取提取楚雄地区川滇金丝桃茎叶中的总黄酮，结果表明，总黄酮的提取率随着温度的升高而增大，70℃时到达最大，而当温度高于70℃时，总黄酮的提取率随着温度的升高而降低，因此楚雄地区川滇金丝桃茎叶中提取总黄酮时，浸提的最佳温度确定为70℃可获得较好效果。

3.2.4 液料比对提取效果的影响

按2.4.4操作，采用不同液料比提取楚雄地区川滇金丝桃茎叶中的总黄酮，结果表明，在其他条件不变的情况下，随着溶剂的用量加大，提取率逐渐增大，当液料比为30:1时，提取率达到最大，之后再增加溶剂的量，提取率基本保持不变，这说明从提取液中析出的总黄酮类化合物达到平衡，因此液料比为30:1可达到较好的效果。

综合上述几个条件，从溶剂的挥发损耗、生产速率、生产成本和总黄酮提取提取率几个方面考虑，选择70%的乙醇溶液为提取剂、浸提时间2.0h、浸提温度70℃、液料比为30:1(mL/g)提取楚雄地区川滇金丝桃茎叶中的总黄酮可获得较好效果。在此条件下用混合川滇金丝桃样品进行三次平行试验，分别测得提取液的吸光度为0.753，0.753，0.751，取平均值0.752，通过回归方程计算得到黄酮的浓度为0.06698mg，提取率为16.745%。在此条件下黄酮的提取率较高。

采用乙醇浸提法提取楚雄地区川滇金丝桃茎叶中的总黄酮，此方法操作简便，对设备要求较低。通过改变乙醇浓度、浸提时间、浸提温度以及液料比，研究了各因素对楚雄地区川滇金丝桃茎叶中黄酮提取率的影响。实验结果表明，楚雄地区川滇金丝桃茎叶中总黄酮的适宜提取条件为:70%的乙醇溶液，浸提时间2.0h，浸提温度70℃，液料比30:1(mL/g)，在此条件下黄酮的提取率较高达16.745%。根据已有资料，贯叶金丝桃中总黄酮含量高达9.25%［12］，新疆腺点金丝桃中总黄酮含量为11.69%［15］，长柱金丝桃中总黄酮含量为6.523%［13］，因此云南楚雄地区川滇金丝桃中总黄酮的含量较高，楚雄地区川滇金丝桃茎叶中有着丰富的黄酮类化合物资源，且分布较广，资源丰富，值得进一步开发。

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