家蚕生物反应器的研究概述

崔振腾，陈亚洁，曾鹏，金卫明，费建明，李玉峰，时连根

（1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2.湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313000）

家蚕生物反应器的研究概述

崔振腾1，陈亚洁1，曾鹏1，金卫明2，费建明2，李玉峰2，时连根1

（1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2.湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313000）

家蚕生物反应器在生产活性成分、表达外源基因、改善蚕丝性能等方面，具有很高的开发利用价值。本文概述了家蚕幼虫反应器、家蚕NPV表达系统反应器、转基因家蚕反应器、家蚕丝腺反应器的研究状况。

家蚕；转基因；丝腺；BmNPV表达系统；生物反应器

家蚕（Bombyxmori）属于鳞翅目蚕蛾科，为开放式血管系统，纤薄而强韧的表皮层包围着一个充满血淋巴及各种器官的空间，整条蚕像一套完全能调节的极其微妙的生物反应器，吃进饲料（桑叶），合成出蛋白质（丝蛋白等）。几千年来，人们利用家蚕能吐丝结茧这一生物反应器机能，大量生产生丝。随着经济发展和科学技术进步，家蚕这一生物反应器机能被用来生产药物等高附价值物质，给古老的养蚕业注入了新的活力。本文对家蚕幼虫反应器、家蚕NPV（Nuclear Polyhedrosis Virus）表达系统反应器、转基因家蚕反应器、家蚕丝腺反应器的研究状况作一简要概述。

1 家蚕幼虫生物反应器

家蚕幼虫以桑叶为饲料，每头蚕在20多d内仅吃桑叶20 g，体重却从刚孵化时的0.5mg增加到5龄期的5 g，增长了10000倍，这是其它任何生物所不能及的。被蚕食下的桑叶在体内经过一系列的分解与吸收，转化成丰富的活性成分并在体内累积，这一高效率物质转化与累积特性，使家蚕幼虫成为活性成分生产的适宜生物反应器，其中1-脱氧野尻霉素（DNJ）、黄酮类化合物、蚕素（PTTH）、蜕皮激素（MH）、三碘甲腺原氨酸（T3）等降血糖的活性成分、不饱和脂肪酸等调节血脂的活性成分、氨基酸等护肝的活性成分，广泛被人们所研究和利用。

家蚕幼虫体中DNJ含量可达0.448%以上，大大高于过去认为富含DNJ的桑叶（0.11%）、野跖草（0.01125%）、风信子（0.0012%）等植物中的DNJ含量，在人肠腔内能竞争性地与α-糖苷酶结合，阻害α-糖苷酶对二糖的水解，使二糖不能被水解成单糖而被直接送入大肠排泄，从而有效地起到了降血糖的作用［1～2］。家蚕幼虫体富含黄酮类化合物，其含量可达23.770 mg/g，并在不同蚕品种、性别、生长发育间存在明显差异，能清除机体内自由基、抗脂质过氧化、促进胰岛素B细胞分泌胰岛素以及抑制机体小肠蔗糖酶、麦芽糖酶、乳糖酶等双糖酶的活性，从而降低糖尿病患者的血糖水平，并阻止并发症的发生［3～5］。PTTH是由脑神经细胞分泌的蛋白质多肽，存在于家蚕各个不同发育阶段，与人类、哺乳动物的胰岛素及类胰岛素生长因子族（IGFS）结构相似，被称为昆虫胰岛素，具有降血糖的功效［6］。MH是一种甾族激素，由前胸腺分泌，在家蚕幼虫体内有α-蜕皮激素和β-蜕皮激素两种类型，具有促进人体细胞生长、刺激真皮细胞分裂、产生新的生命细胞和生殖细胞、提高人体抗衰老、促进胰岛细胞更新再生等，以达到治疗糖尿病的作用。家蚕幼虫体中T3的干物含量为0.913 ng/g，可影响机体胰岛素水平并作用于其受体［7］，是另一条降血糖途径。

家蚕幼虫体含有高比例的不饱和脂肪酸（占油脂量的93%），其中属于人体必需脂肪酸的α-亚麻酸、亚油酸含量高达30.95%、13.49%，此外还含有较高的维生素A。α-亚麻酸具有明显的降血压、降血脂、降胆固醇的作用，同时也具有较好的抗炎作用［8］。以家蚕幼虫为主要原料制成的金蚕宝降脂Ⅰ号和金蚕宝降脂Ⅱ号对高脂模型小鼠的血脂水平具有明显的改善作用，并显示出很好的剂量效应关系［9］。

家蚕幼虫体富含氨其酸，总量的46.51%，为鲜蚕蛹的4～5倍。必需氨基酸占总氨基酸量的41.80%。其中甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸分别占16%、11.8%、8.4%［10］。如此丰富的氨其酸组成，适用于蛋白代谢障碍、白蛋白低下的患者，也有利于提高机体免疫力、强身健体等，从而间接地起到护肝作用。以熟蚕粉为主要原料研制成的五龄丸，对慢性、迁延性肝炎、肝炎肝硬化（稳定期）、急性黄疸性肝炎（迁延恢复期）患者均表现出良好的临床疗效［11］。

2 家蚕NPV表达系统生物反应器

家蚕NPV基因组是超螺旋的闭环双链DNA，主要编码100余种结构蛋白和非结构蛋白，其中多角体蛋白基因具有非常强有力的启动子，在病毒感染后期进行高效表达，合成量能达到全部蛋白质量的20～ 30%，但多角体蛋白基因不是病毒复制的必需基因，多角体蛋白基因即使部分或全部被其它外源基因取代，仍能形成有感染性的病毒粒子。根据这一特性，将外源基因取代多角体蛋白基因的全部或一部分并处于多角体蛋白基因启动子的控制之下，形成重组质粒，与野生型家蚕NPV DNA共转染于家蚕细胞，外源基因通过体内同源重组而置换出多角体蛋白基因，然后通过空斑筛选等方法分离、纯化出重组病毒，纯化的重组病毒在培养细胞中扩增繁殖后，感染家蚕体，外源基因大量表达，收集蚕血淋巴，经过离心、沉淀、透析和纯化等手段分离纯化出外源蛋白。

家蚕NPV表达系统最早由Maeda于1984年开发出来，并首次在家蚕幼虫体中表达了人α-干扰素基因，表达的产物不仅具有生理活性，而且表达量是其它真核生物表达系统最高表达量的千倍以上［12］，显示出明显的优势，引起了人们的强烈兴趣。至今巳用家蚕NPV表达系统在家蚕体内成功地表达了乙肝表面抗原的M蛋白基因、丙肝病毒核心蛋白C的完整基因和包膜蛋白E1完整基因及部分E2基因、人嗜T淋巴细胞病毒I型基因env和p40、人免疫缺陷病毒基因gag、gpl20、gp41、pol、sor等，表达产物作为人疫苗而使用［13～15］；表达了人生长激素、人β-干扰素、类胰岛素样生长因子-Ⅱ融合蛋白、人白细胞介素3、人表皮生长因子、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、人血小板生成素、人促红细胞生成素、人体血液凝固阻塞因子等，作为人药而利用［16～19］；表达了小鼠白细胞介素3、猪生长激素、草鱼的生长因子、禽马立克氏病毒糖蛋白B抗原、传染性鸡法氏囊病病毒主要宿主保护性抗原VP2蛋白等，作为兽药而利用［20～21］；表达了利尿激素基因、保幼激素酯酶基因、澳洲蝎毒索液的AaIT基因、慈姑蛋白酶抑制剂B基因等，表达产物用于害虫防治［22～25］。其中有些已经产业化，产生了巨大的社会效益和经济效益。

3 转基因家蚕生物反应器

将外源基因转入并整合进家蚕基因组，使其能稳定传代与高效表达，获得目的转基因家蚕。标准化繁育与饲养转基因家蚕，外源基因随着家蚕的高速生长而大量表达，从而利用此转基因家蚕生物反应器可大量获取外源蛋白。转基因家蚕生物反应器克服了杆状病毒等载体表达系统中外源基因不能稳定传代、需要反复扩增繁殖与接种、工作量大以及稳定性差等诸多问题，具有很高的产业化优势。

Tamura等于2000年通过将家蚕细胞质肌动蛋白基因启动子控制绿色荧光蛋白基因的转基因载体和表达转座酶辅助质粒一起显微注射入家蚕卵，经过筛选成功获得120头发荧光的转基因家蚕，初步建立了家蚕转基因技术体系［26］。此后家蚕转基因技术不断改进，转基因家蚕生物反应器研究快速进展。家蚕转基因技术体系主要包括转基因载体构建和导入宿主表达二个方面。转基因载体通常由启动子、外源基因、筛选标志基因、酶切位点、复制启动位点等遗传学元件构成，其构建恰当与否，将直接影响到基因转移与整合的成败。目前在转基因家蚕研究中，常用的是以转座子为基础构建转基因载体，就是将外源基因插入转座子编码转座酶的序列内，构成一个基因转移载体，另外再构建一个表达转座酶的辅助质粒，将基因转移载体和辅助质粒同时导入家蚕，辅助质粒提供转座酶，引发基因转移载体中携带外源基因片段的转座子序列发生转移，将外源基因插入宿主基因组内，得到外源基因稳定整合的转基因家蚕。

将转基因载体导入家蚕体表达的方法主要有显微注射法、电穿孔法、精子介导法等。①显微注射法是在显微镜下，先用钨针在家蚕受精卵的一端开孔，刺破坚硬卵壳，然后在孔口处插入玻璃针刺人卵内，同时注人外源基因的方法［27］。蚕卵在产下2～3 h后发生雌、雄核岛的融合，形成受精卵，以后每隔1 h分裂1次，约12 h后形成胞胚，25 h后形成囊胚，10 d后形成幼虫孵化。外源基因转移人受精卵的时间应该在分裂核时期，因为此时分裂核尚未形成核膜，转移入卵内的外源DNA较易与分裂核接触而整合到核内基因组中，但卵龄越早的受精卵生命力越弱，越易造成损伤致死。在产下12 h后转移入蚕卵内，则转基因不能成功，因为此时的分裂核已形成核膜，外源基因难以进入核内。②电穿孔法是通过瞬时高压造成细胞膜穿孔，将外源基因由孔进入蚕卵内的方法，由于瞬时高压造成细胞膜的穿孔是可修复的，所以较玻璃针注射造成损伤致死的程度要小［28］。另外，有人还利用卵壳上5000～10000个气孔（口直径3～4μm），采取脉冲交变电场介导外源基因由气孔进人卵内。③精子介导法是将成熟精子与外源基因进行预培养后，通过授精使精子携带外源基因进人卵中的方法，其应用大致有以下四种方式：第一是将外源基因先注人处女蛾交配囊中，再令其与雄蛾交配，进人交配囊的精子携带外源基因授精；第二是先令雌雄蛾交配，再向交配囊中注射外源基因；第三是从雌雄蛾交配特定时间后的交配囊中取出精液，将精液与外源基因孵育一定时间，然后再将其以人工授精的方法注人新鲜处女蛾交配囊内；第四是将含外源基因的质粒注人5龄蚕精巢，将其羽化后的雄蛾与处女蛾交配［29］。

4 家蚕丝腺生物反应器

5龄后期家蚕体腔内充满后部丝腺，丝素蛋白基因在后部丝腺中特异而高效地得到表达。在家蚕5龄后期的3 d中，后部丝腺的每个细胞能够合成105个（约250μg）丝素蛋白分子，整个丝腺每秒能合成6×109个丝素蛋白分子，比肝细胞合成血清白蛋白快60倍以上，这样高的蛋白合成速度在现有的其他动物细胞内是罕见的。如将外源基因置于丝素蛋白基因启动子的调控下，就能利用家蚕丝腺细胞高效表达外源基因，不仅表达量几十倍地高于家蚕NPV表达系统等，而且表达的外源蛋白纯度高，无需进行烦琐的下游浓缩和提纯处理。为此，家蚕丝腺生物反应器具有非常大的开发前景。

家蚕丝腺生物反应器表达外源基因主要有两个方面的应用：一是开发家蚕的生产潜力，利用家蚕表达外源基因来生产外源蛋白；二是利用转基因操作来改善蚕丝丝素的性能。

4.1 家蚕丝腺生物反应器生产外源蛋白

自从1998年Marshal［30］提出将外源基因置于丝素蛋白启动子调控下，在丝腺中生产外源蛋白的构想以来，利用丝腺细胞完整地表达生产外源蛋白的研究取得了很大成果。朱成钢等从家蚕基因组DNA中克隆了丝素蛋白轻链基因中长度分别为5 kb和0.5 kb的两个片段；在绿色荧光蛋白基因前端加上凝血酶的识别序列，将其克隆到轻链基因5 kb和0.5 kb两个片段中并使其具有正确的渎码框，再与轻链基因融合；将这一融合DNA片段克隆到pBacPAK8转移载体上，构建成一种新型的家蚕打靶载体pBac FL53TG，使绿色荧光蛋白基因在家蚕丝腺内特异地表达［31］。目前日本广岛县产业科学技术研究所研究人员构建了一个能生产包括普通丝蛋白、荧光标识物和缩短型人类Ⅲ型胶原前驱体分子的融合蛋白质的DNA序列，将该DNA序列插入载体，再用显微注射法将载体质粒导入蚕卵，家蚕成熟后，其后部丝腺细胞将合成融合蛋白，并将其转运至细胞外经吐丝结成茧，从茧层中即可提取分离获得人胶原蛋白［32］。

4.2 家蚕丝腺生物反应器改善蚕丝性能

蚕丝具有优良的光泽、色调、吸湿放湿性、保温性、难燃性、吸气性以及吸收紫外线和放射性等特性，但在摩擦强度、屈曲强度、伸长疲劳度、染色性、抗皱性等性质上不及其他纤维。如用其他优等丝素基因置换家蚕丝素蛋白基因，就能让家蚕吐出其他优等丝；如用外源基因置换部分家蚕丝素蛋白基因，或将外源基因置于丝素白基因下游，使外源基因与家蚕丝素基因同时同步地表达，就能改善家蚕蚕丝的性能。

李振刚等（1997）将天蚕丝素基因插入酵母人工染色体（YAC）载体中，构建包含了整个天蚕丝素基因编码区及侧翼序列的天蚕丝素基因的YAC克隆（Afy-1），从Afy-1中制备出Afy-1 DNA，采用显微注射法将Afy-1 DNA导入家蚕受精卵，在F1代中出现了约20%的淡绿色茧，F2代中有近60%茧为淡绿色，分子杂交实验证明天蚕丝素基因已经整合到家蚕基因组中，丝素蛋白氨基酸组分分析、茧色及茧丝溶解性比较也确定天蚕丝素基因在转基因家蚕中得到了表达［33］。

蜘蛛丝不仅具有蚕丝般的柔软和光泽，并且其力学强度明显比蚕丝大，它与强度最高的碳纤维相接近，因此蜘蛛丝在国防、军事（防弹衣）、建筑等领域具有广阔应用前景。将蜘蛛丝的牵引丝基因替换家蚕丝素重链基因，构建一个完整的在家蚕丝素重链启动子引导下的蜘蛛丝牵引丝基因表达单元，再将此表达单元导入piggyBac质粒构建转基因载体，用显微注射法将转基因载体注入蚕卵，蜘蛛丝基因在家蚕丝腺中得到表达，使家蚕吐出含有蜘蛛丝蛋白的优良复合茧丝［34］。

［1］刘淑梅.家蚕体主要药用活性成分的研究［D］.浙江大学：硕士学位论文，2004.

［2］Hiroshi Nojima，lkuko Kimura，Fu-jun Chen，et al.Homonojirimyein isomers and glycosides from aglaonema treuvii［J］.J.Nat.Prod.，1997，60：98～101.

［3］金洁，刘淑梅，时连根.家蚕幼虫体黄酮类化合物含量的变化规律［J］.蚕业科学，2005，31（2）：141～144.

［4］俞灵莺，李向荣.植物黄酮抗糖尿病及其并发症的研究进展［J］.国外医学—卫生学分册，2000，27（6）：331～334.

［5］俞灵鸳，李向荣，方晓.桑叶总黄酮对糖尿病大鼠小肠双糖酶的抑制作用［J］.中华内分泌代谢杂志，2002，18（4）：313～315.

［6］何家禄，易咏竹.家蚕蛹粉对高血糖动物模型的降血糖作用及试食试验［J］.中国蚕业，2003，24（1）：66～67.

［7］桂仲争，陈杰，陈伟华，等.全蚕粉（SP）降血糖的作用效果及其机理的研究［J］.蚕业科学，2001，27（2）：114～118.

［8］陶国琴，李晨.α-亚麻酸的保健功效及其应用［J］.食品科学，2000，21（2）：l40～143.

［9］陈智毅，廖森泰，李清兵，等.多化性黄血蚕的食用和药用价值的研究［J］.蚕业科学，2002，28（2）：173～176.

［10］陈智毅，陈列辉，李清兵，等.金蚕宝护肝制剂的氨基酸分析［J］.广东蚕业，2002，36（1）：35～37.

［11］陈智毅，陈列辉，李清兵，等.金蚕宝对CC14所致实验性肝损伤的保护作用［J］.蚕业科学.2002，28（4）：347～348.

［12］Maeds S，Kawsi T，Obinata M，et al.Production of human α-interferon in silkworm using a baculovirus vector［J］. Nature，1985，315：992～594.

［13］Higashihashi N，Arai Y，Enjo T，et al.High-level expression and characterization of hepatitis B virus surface antigen in silkworm using a baculovirus vector［J］.J Virol Methods，1991，35（3）：159～167.

［14］曹广力，张志芳，张耀洲，等.应用重组家蚕核型多角体病毒在蚕体中表达人丙型肝炎病毒C区及E1区基因［J］.蚕业科学，1999，25（4）：230～236.

［15］Maeda S.Expression of foreign genes insects using baculovirus vectors［J］.Anmu.Rew.Entomol.，1989，34：357

［16］Kadono-Okuda K，Yamamoto M，Higashino Y，et a1.Beculovirus-mediated production of the human growth hormone in larvae of the silkworm Bombyx mori［J］.Biochem Biophys Commun，1995，213（2）：389～395.

［17］邓继先，王少飞，杨琴，等.用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素［J］.生物工程学报，1995，11（2）：126～131.

［18］Marumoto Y，Sato Y，Fujiwara H，et al.Hyperproduction of polyhedrin-IGF-I fusion protein in silkworm larvae infected with recombinant Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus［J］.JGen Viro1，1987，68：2599～2606.

［19］何家禄，吴祥甫.重组家蚕核型多角体病毒—家蚕表达系统的产业化［J］.国外农学—蚕业，1994，57（1）：6～11.

［20］Mlyajima A，Schreurs J，Otsu K，et al.Use of the silkworm Bombyx mori and an insect baculovirus for highlevel expression and secretion of biologically active mouse interleukin-3［J］.Gene，1987，58：373～281.

［21］Ho WKK，Meng ZQ，Lia HR，et a1.Expression of grass carp growth hormone by baculovirus in silkworm larvae［J］.Biochim Biophys Acta，1998，1381（3）：331～339.

［22］Maeda S.Increased insecticidal effect by a recombinant baculovirus carrying a synthetic diuretic hormone gene［J］.Biophys Biochem Res Commun，1989，165：1177～1183.

［23］Hammock B D，Bonaing B C，Possee R D，et al.Expression and effects of juvenile hormone esterase in a baculovirus vector［J］.Nature，1990，344：458～（46［24］Maeda S，Volrath S L，Hanzlid T N，et al.Insecticidal effect of an insects pecific neurotoxin expressed by a recombinant baculovirus［J］.Virology，1991，184：777～780.

［25］季平，张志劳，何家禄，等.慈茹蛋白酶抑制剂B基因在家蚕幼虫和蛹体中的表达［J］.生物化学与生物物理学报，1997，29（1）：17～22.

［26］Tamura T，Thibert C，Royer C，et a1.A piggyBae-derived vector eficiently promotes germ-line transformation in the silkworm Bombyxmori L.［J］.Nat Biotechnol，2000，18：81～84.

［27］陈维存，劳海华.外源基因导入蚕体的研究进展［J］.广东蚕业，2000，34（4）：58～62.

［28］范久戈，刘明辉，肖林珍.家蚕转基因研究进展［J］.中国蚕业，1999，（4）：7～8.

［29］王昌河，蒋平，曹林，等.家蚕生物反应器的研究进展及开发前景［J］.四川动物，2004，23（4）：368～373.

［30］Marshall A.I'he insects are coming［J］.Nature Biotech，1998.16：530～553.

［31］朱成钢，金勇丰，史锋，等.用丝心蛋白轻链基因构建转基因家蚕基因打靶载体［J］.农业生物技术学报，2002，10（2）：171～175.

［32］Kathryn Senior.Transgenic silkworms spin human collagen［J］.Lancet，2002，360：2053.

［33］李振刚，周丛照，唐恒立，等.YAC介导的天蚕丝素基因向家蚕的转移—天蚕丝素基—YAC克隆在家蚕的表达［J］，昆虫学报，1997，40（1）：1～5.

［34］张袁松，赵天福，赵爱春，等.转基因家蚕生产含蜘蛛丝蛋白的新型复合茧丝纤维［J］.纺织学报，2012，33（5）：1～5.

Review on the Research of Bombyx mori Bioreactor

CUIZhen-teng1,CHEN Ya-jie1,ZENG Peng1,JINW ei-m ing2,FEI Jian-m ing2, LIYu-feng2,SHI Lian-gen1

（1.College of Animal Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China; 2.Huzhou Academy of Agricultural Sciences,Huzhou 313000 Zhejiang,China）

The bioreactor of the silkworm,Bombyx mori showed high development and utilization value in producing active ingredients,expressing foreign genes,and improving properties of silkworm silk etc.The research advancement of silkworm larvae bioreactor,Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus(BmNPV)expression system bioreactor,transgenic Bombyx moribioreactor,silk glands bioreactor ismainly expounded in this paper.

Bombyxmori;transgenic;silk gland;BmNPV expression system;bioreactor

S881.2

A

0258-4069［2013］03-001-05

湖州市科技支撑计划攻关项目（编号：2011GG16）

崔振腾（1990-），男，山东滨州人，硕士。主要从事蚕桑资源及其分子生物学研究。E-mail：mengstateng@163.com

时连根，男，教授。E-mail：slgsilk@zju.edu.cn