丝素组织工程支架的结构相容性与细胞相容性

刘小甜，杨明英，邓连霞，朱良均

（浙江大学 动物科学学院应用生物资源研究所，浙江 杭州，310058）

1 前言

组织工程技术是一项用于治疗组织和器官缺损的新手段，该技术通过运用细胞生物学和工程学的原理与技术，设计、构建、改良和培养生物活体组织，以修复和重建组织器官的结构和功能[1]。组织工程技术的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。其中，支架材料是该复合体的主要元素之一，其主要作用包括：①为细胞粘附提供物理支撑，以支持新生组织的生长，并能被生物降解；②为细胞增殖、分化、代谢提供空间；③提供特定的宏观、微观结构，引导细胞构建特定功能的组织或器官；④传递化学或力学信号，调控细胞的形状。

丝素是蚕丝的一种天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70%～80%，含有18种氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸约占总组成的80%以上。Altman等[2]认为丝素蛋白具有如下优点：①与其他天然纤维和许多高性能合成纤维相比，有独特的力学性能；②在外科领域的应用已有很长历史；③可加工成膜、颗粒、纤维、支架等多种形态，加工工艺相对简单；④可通过某些氨基酸的氨基和侧链的化学修饰，较容易地改变表面性能；⑤在体内外可以缓慢降解；⑥对生物体无危险性，对其免疫系统的副反应较小。因此，丝素蛋白已被广泛应用于组织工程的研究。

2 丝素蛋白支架的生物相容性

组织工程支架材料的生物相容性，包括生物降解性、结构相容性和细胞相容性等多方面的要求。支架材料的生物降解性，包括生物可降解程度、降解速率影响因素、降解机理等。结构相容性是指，为了满足生理负荷的需要，支架应提供暂时性的物理支持以承受外部和内部的应力直至新生组织形成，因而必须与新生组织以及机体的植入部位达到一定的力学匹配。细胞相容性包括细胞在材料上的黏附，迁移，增殖，分化，凋亡等情况。本文重点介绍丝素支架材料的结构相容性和细胞相容性的研究情况。

2.1 丝素支架材料的结构相容性

刘洋等[4]以犬牙周膜细胞为种子细胞，以壳聚糖—丝素蛋白—磷酸三钙复合物作为支架材料，研究该材料用于牙周组织工程的特征。研究表明，以犬牙周膜细胞为种子细胞，壳聚糖—丝素蛋白—磷酸三钙复合物支架材料与单纯壳聚糖支架材料相比，有更适宜的多孔结构及较理想的骨诱导作用，具有更强的结构相容性和再生能力，可作为牙周组织再生的理想支架材料。

鞠刚等[5]用软骨诱导脂肪干细胞接种于丝素蛋白/羟基磷灰石支架材料上，发现复合材料无论是在机械强度上还是诱导分化上均比单一材料更符合软骨组织的生理结构和特点，新生的组织在大体和组织形态上类似正常软骨组织，能够形成透明软骨，修复动物膝关节全层软骨缺损，重建关节的解剖结构和功能。脂肪干细胞和SF/HA复合支架体内诱导产生的软骨样组织和软骨下骨组织与周围正常组织融合良好，为今后组织工程修复软骨中复合材料的应用进行了新的尝试并提供了可能性。

Sarmistha Talukdar等[6]用冷冻干燥法制得丝素蛋白三维支架，研究了支架与接种细胞的密度之间的相互影响。结果表明，丝素蛋白支架作为一个细胞相容性良好的载体，能够克服潜在的不足，对细胞的生长和扩增有良好的支持作用。而接种细胞的密度对材料的生物化学和生物力学方面的特性也有显著地实质性影响，在一定范围内，密度越大，材料的韧性越好。

Mengqing Zang等[7]通过冷冻干燥法制得了导管状的丝素—壳聚糖混合支架，将鼠的软骨细胞接种在支架上，并将支架用一层软骨膜包裹，培养6周后将所得到的支架—细胞—软骨膜材料移植到裸鼠背部皮下袋中，试验结果表明所得的支架—细胞—软骨膜材料在小鼠体内虽然并未形成类似天然的导管，但该支架材料具有良好的生物相容性，促进细胞的生长和扩增使其具有极好的力学性能，向气管移植方面研究出类似天然气管的功能支架材料迈进了一步。

Nandana Bhardwaj等[8]制备了丝素和壳聚糖的多孔聚电解质混合物，电镜下观察材料的孔径为100～160 μm，具有良好的相互连通性，高孔隙率和适宜的抗菌性。与单一材料相比较而言，材料呈现出较高的抗压强度和弹性模量，且促进猫的成纤维细胞的生长和粘附，具有良好的生物相容性，是一种很有前景的软骨组织工程材料。

Jiankang He等[9]用自上而下组装的方法制得丝素—明胶微流体复合支架材料。研究表明SF/G比例为2∶2时，复合材料具有较好的结构特征，机械性能和生物学特性。材料中的微流体孔道在由上而下组装的过程中保持良好并互相连通。研究设想若将微流体孔道中灌注培养基来提高材料的养分和含氧量，则材料有望用作厚组织工程材料。

2.2 丝素支架材料的细胞相容性

佘荣峰等[10]将兔骨髓间充质干细胞分离培养、诱导后，与丝素蛋白/壳聚糖三维支架材料体外共培养。研究表明，经诱导后的骨髓间充质干细胞在支架材料上黏附、生长良好，材料无细胞毒性，保持正常的分裂增殖速度；随时间的增加，细胞黏附率增加，材料组较对照组黏附率强。扫描电镜观察发现细胞接种48 h后细胞生长良好，与支架黏附紧密，增殖分裂正常。说明丝素蛋白/壳聚糖三维支架材料具有良好的细胞相容性，可以作为软骨组织工程研究种子细胞的载体。

林静等[11]用盐沥滤法制备三维多孔丝素支架。在丝素多孔支架上培养人成骨肉瘤细胞、成纤维细胞及肝细胞。研究材料的细胞相容性，发现多种动物细胞在盐沥滤法所制备的丝素多孔支架材料上能够很好地黏附和增殖。并通过调整丝素水溶液的浓度、溶解丝素溶剂体系、NaCl添加量和NaCl粒径，可以改变材料的力学性能、孔隙率、孔壁厚度等，制备出结构和性质可以调控的三维支架。

侯春春[12]以丝素蛋白溶液和自制碳酸钙为原料，通过调节其共混质量比、采用不同的制备方法，探索丝素蛋白/碳酸钙复合支架的制备工艺，并对其理化性能和生物相容性进行了相关测试。该试验中通过急性全身毒性试验、皮肤致敏试验、皮内刺激试验、热源试验、溶血试验、细胞毒性试验、体外降解率测定等一系列试验证实，复合支架具有良好的生物相容性，具备发展成为优越的骨组织工程材料的潜力。

Laura J.Bray等[13]制作的双层丝素支架材料，并在材料上培养角膜缘上皮细胞（L-EC）和角膜缘间质干细胞（L-MSC），比较观察了两种细胞在有孔和无孔材料上的生长和表型。研究表明，两种细胞在有孔材料和无孔材料上生长表现出不同的形态。两种细胞在双层丝素支架材料上的生长与单层丝素膜呈现相似的形态，该结果支持由丝素三维支架制备角膜缘的可行性。

Chinmoy Patra等[14]将一种印度柞蚕丝制备丝素蛋白支架用于体外的心脏修复。试验将三日龄小鼠心室心肌细胞接种于材料上，测试了细胞对材料的粘附性，细胞的代谢活性，细胞对外来刺激的反应，细胞与细胞之间的信息传递以及细胞的收缩性。研究表明，丝素蛋白具有与纤连蛋白——心肌细胞基质中的一种成分类似的特性。而且这种柞蚕丝蛋白含有RGD序列，呈现出比普通丝素更优越的性能。因此，该材料有望用于心脏疾病的修复。

Tullia Maraldi等[15]研究了人羊水膜干细胞（AF⁃SCs）培养在不同多孔支架上时合成矿化细胞外基质的潜力，多孔支架材料分别由胶原蛋白，外消旋聚乳酸和丝素蛋白制备。研究表明，三维的支架材料的应用使AFSCs成骨细胞的分化能力和矿化细胞外基质的产量都明显高于二维材料。可见AFSCs具有在体内产生三维矿化生物工程材料的巨大潜力，而且丝素蛋白可能是用来修复临界骨缺损的有效支架材料。

3 结语

丝素蛋白作为一种天然的高分子材料，具有良好的生物相容性，降解性，可改良性和拉伸机械性能等。丝素蛋白是由天然氨基酸疏水段和亲水段组成的嵌段复合物，疏水段可通过氢键和疏水基团的相互作用形成β-平面或晶体，从而产生较高的力学强度，为丝素支架提供优良的结构相容性。而且，丝素蛋白作为一种良好的细胞生长介质，能够很好地促进细胞的生长和繁殖，具有良好的细胞相容性。因此，丝素蛋白支架材料在组织工程领域具有很好的开发和应用前景。

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